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Entwicklung innovativer Mikroreaktoren zur frühen Identifizierung industriell relevanter Enzymreaktionen am Beispiel der Esterase

Description: Das Projekt "Entwicklung innovativer Mikroreaktoren zur frühen Identifizierung industriell relevanter Enzymreaktionen am Beispiel der Esterase" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität des Saarlandes, Lehrstuhl für Technische Biochemie durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Durch moderne Methoden der Molekularbiologie kann in kurzer Zeit eine Vielzahl von Variationen von Enzymen erzeugt werden, von deren gezieltem Einsatz man höhere Wertschöpfungen bei reduzierter Umweltbelastung erwartet. In diesem Projekt wurden Systeme etabliert, die es gestatten, biokatalytische Reaktionen mit Umsetzung von Sauerstoff und/oder Säure in großer Zahl zu quantifizieren. Dazu wurden Mikrotiterplatten mit integrierter optischer Sensorik entwickelt und mit pH-Regelung sowie einer angepassten Screening-Methodik eingesetzt. Eine Esterase wurde rationell und evolutiv optimiert. Diese wurde mittels eines Autotransporter-Systems in E. coli an der Oberfläche der Zellen exprimert. Das Screening dieser Zellen wird mittels der pH-Sensorplatten durchgeführt. Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden; In einem Projektteil wurden Mikrotiterplatten mit integrierten Optosensoren für Sauerstoff und pH (Messung von Fluoreszenzabschwächung und -abklingzeit) entwickelt. Durch intrinsische Referenzierung sind die Platten kalibrationsarm. Die entwickelten Sensoren wurden charakterisiert anhand der Ansprechzeit, der Reproduzierbarkeit und der Querempfindlichkeit. Die Durchmischung in Mikrotiterplatten wurde durch Analyse von pH-Antworten auf Pulse von Alkali charakterisiert. Enzymatische Reaktionen wurden mittels der immobilisierten Sensoren anhand der pH- oder Sauerstoffänderung beobachtet. Zur Bestimmung kinetischer Parameter wurden geeignete Auswertemethoden unter Einsatz mathematischer Modelle erarbeitet, die für das industrielle Screening geeignet sind. Die Esterase EstA von B.gladioli und eine künstlich erzeugte Esterase EsjA wurden evolutiv variiert zum Einsatz als technischer Biokatalysator. Es geht dabei vornehmlich um die Racematspaltung von Estern. Ein Autotransporter-System in E. coli wurde für die Sekretion von Varianten dieser Esterase genutzt. In Verbindung mit den integrierten Platten und den Screening-Methoden ist eine neue Methode unter Verwendung ganzer Zellen zur schnellen Erzeugung und Testung der katalytischen Aktivität von Enzymen etabliert worden. Fazit: Mit den drei neuen in diesem Projekt entwickelten Mikrotiterplatten mit integrierten Sensoren für pH und Sauerstoff können Enzymkinetiken bestimmt werden. Diese sind in konventionellen Fluoreszenzreadern direkt einsetzbar und benötigen nur einen minimalen Aufwand für die Kalibrierung. Mit diesen Platten konnten umfangreiche Studien zum Mischen und Sauerstofftransport in Mikrotiterplatten durchgeführt werden. Die Platten sind nun kommerziell erhältlich und können auch zum Züchten von Zellen verschiedenster Art eingesetzt werden. Enzyme können mit einem neuen Autotransportersystem in E. coli exprimiert, an die Oberfläche sekretiert und dort aktiv präsentiert werden. Mit diesen Zellen wurden nach molekularer Evolution erste Screening-Tests mit den pH-Platten durchgeführt.

Types:

SupportProgram

Origin: /Bund/UBA/UFORDAT

Tags: Fluoreszenz ? Kolibakterien ? Saarland ? Esterase ? Kalibrierung ? Katalysator ? Sauerstoff ? Sensor ? Ester ? Mikrobiologie ? Molekularbiologie ? Bioreaktor ? Chemische Analyse ? Enzym ? Katalyse ? Messtechnik ? Umweltbelastung ? Sensorische Bestimmung ? Biotechnologie ? Chemisches Verfahren ? Evolution ? Innovation ? Mathematisches Modell ? Messdaten ? pH-Wert ? Quantitative Analyse ? Studie ? Säure ? Chemische Base ? Umweltentlastung ? Umweltverträglichkeit ? Chemische Reaktion ? Verfahren ? Datenerhebung ? Mikroreaktor ? Schwerpunkt-Biotechnologie ? Analytik ? Siebung ?

Region: Saarland

Bounding box: 6.96083° .. 6.96083° x 49.40472° .. 49.40472°

License: cc-by-nc-nd/4.0

Language: Deutsch

Organisations

Time ranges: 2000-05-01 - 2003-12-31

Status

Quality score

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