Description: Das Projekt "Untersuchung der zellulären Wirkung von Ozon - Entwicklung einer nicht invasiven Methode zum Nachweis oxidativ veränderter DNA-Basen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Deutsches Krebsforschungszentrum - Stiftung des öffentlichen Rechts durchgeführt. Unter der Fragestellung, ob Ozon bei Inhalation umweltrelevanter Konzentrationen in der Lage ist, oxidativen Streß und damit oxidierte DNA Basen zu verursachen, sollte ein neues Nachweisverfahren für oxidierte DNA Basen, insbesondere especially 8-Oxo-7,8-dihydro-2?-desoxyguanosine (8-oxodG), entwickelt werden. Dies sollte basierend auf der 'matrix assisted laser desorption ionisation time of flight mass spectrometry' ('MALDI-TOF' MS) sowohl die Identifikation als auch die Quantifizierung des Analyten erlauben. Aus dem Potential von Ozon, oxidativen Streß zu verursachen und oxidierte DNA-Basen zu induzieren, welche Mutationen verursachen können und damit potentiell Krebs verursachen können, sollte eine Aussage über dessen Gentoxizität unter umweltrelevanten Bedingungen getroffen werden. Im Rahmen von Vorversuchen wurden HL60 Zellen gegenüber verschiedenen Ozonkonzentrationen exponiert. Durch den mit FPG-Protein modifizierten Comet-Assay konnten ab einer Konzentration von 8 mg/m3 und einer Expositionszeit von 30 min eine Zunahme der DNA-Strangbrüche und der FPG-sensitiven Läsionen beobachtet werden. Daß der Effekt erst bei relativ hohen, nicht umweltrelevanten Konzentrationen auftritt, liegt an der geringen Empfindlichkeit dieser Zellinie gegenüber oxidativer Schädigung, wie durch weitere Untersuchungen nachgewiesen werden konnte. Ferner wurde ein Schadensprofil durch Einsatz verschiedener Reparaturenzyme im Plasmid-Relaxation-Assay für die Ozonschädigung an isolierter Plasmid-DNA aufgenommen. Hier überweigt die Bildung FPG- und Endonuklease-III sensitiver Läsionen. Ein solches Schadensprofil wurde bisher durch keinen anderen oxidativen Einfluß beobachtet. Durch weitere Untersuchungen ließe sich hieraus ein Einblick in die mechanistischen Aspekte der Ozonreaktion mit DNA gewinnen. Ebenfalls wurden die Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit des Effekts überprüft. Zum massenspektrometrischen Nachweis von 8-oxodG aus Urin war es nötig, zunächst den Analyten aufzukonzentrieren und zu reinigen. Hierzu mußte eine neue Immunoaffinitätschromatographie entwickelt, da die in der Literatur beschriebene nicht verwendet werden konnte. Unter Verwendung eines neuen Aufreinigungsverfahren zur Isolierung des monoklonalen Antikörpers 1F7 aus Zellkulturüberstand war es möglich, Immunoaffinitätssäulen mit hoher Kapazität und Spezifität herzustellen. Die immunoaffinitätschromtographische Aufreinigung wurde validiert und die Wiederfindung mit 85 % bestimmt. Bei der Entwicklung der MALDI-TOF MS Methode mußte zunächst die Fragmentierung des Analyten, die zwar einerseits eine zusätzliches Identifikation erlaubt, aber andererseits die Nachweisgrenze verschlechtert, unterdrückt werden. Dies gelang durch Verwendung von 2-Hydroxy-5-methoxybenzoesäure als Matrixmaterial und einen schichtförmigen Matrixaufbau (Laminat Matrix ? Probe ? Matrix). (Text gekürzt)
Types:
SupportProgram
Origin: /Bund/UBA/UFORDAT
Tags: Ozon ? Ozonwert ? Inhalation ? Mutation ? DNA ? Urin ? Laser ? Umweltauswirkung ? Antikörper ? Expositionsdauer ? Genotoxizität ? Massenspektrometrie ? Öffentliches Recht ? Probenaufbereitung ? Stress ? Chemikalien ? Desorption ? Exposition ? Nachweisgrenze ? Oxidation ? Protein ? Umweltforschung ? Zelle ? Ionisation ? Isolierung ? Plasmid ?
Region: Baden-Württemberg
Bounding box: 9° .. 9° x 48.5° .. 48.5°
License: cc-by-nc-nd/4.0
Language: Deutsch
Time ranges: 1997-01-01 - 1998-12-31
Webseite zum Förderprojekt
http://fachdokumente.lubw.baden-wuerttemberg.de/servlet/is/40038/pugl96003SBer.pdf?command=downloadContent&filename=pugl96003SBer.pdf&FIS=203 (Webseite)Accessed 1 times.