Das Projekt "Teilprojekt C" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Fraunhofer-Zentrum für Chemisch-Biotechnologische Prozesse durchgeführt. 2,5-Furandicarboxysäure (FDCA) ist eine biobasierende Alternative zur petrochemisch produzierten Terephtalsäure, welche zur Herstellung von PET und Polyestern für die Verpackungs- und Textilindustrie verwendet wird. Somit besteht ein großer Markt für diese Plattformchemikalie. Der Fokus des beantragten Vorhabens liegt auf der Entwicklung von maßgeschneiderten Enzymen unter Nutzung der nicht-pathogenen Hefen Arxula adeninivorans und Hansenula polymorpha. Ziel ist die Enzymkatalyse der Reaktion von 5-Hydroxymethylfurfural/5-Hydroxymethylfurfurol (HMF/HMFOH) zu FDCA, eine Nutzung von Roh-HMF direkt aus der Synthese von Zuckern als Substrat (und/oder HMFOH) sowie die effiziente biotechnischen Umsetzung, um einen ökonomischem Gesamtprozess zu ermöglichen. Am IPK werden zwei Ansätze verfolgt: (1) Intrazelluläre bakterielle HMF-Oxidase (HMFO) und (2) gentechnologisch maßgeschneiderte Arylalkoholoxidase (AAOm), sowohl als Ganzzell-Katalyse als auch isoliert/immobilisiert. Der Ansatz mit der höchsten Effizienz wird weiterentwickelt und optimiert. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeiten, die Etablierung eines effektiven und robusten enzymatischen Katalyse-Prozesses wird von ASA durchgeführt. Der zusätzliche innovative Aspekt ist die Nutzung alternativer Substrate. Der Fermentationsprozess wird an verschiedene Zucker aus der Lignozellulose angepasst, die durch den Organosolv-Aufschluss am Fraunhofer CBP produziert werden. Dies ist ein wichtiger Schritt zur Entwicklung eines wirtschaftlichen und nachhaltigen Verfahrens. Das ausgewählte Substrat für die Enzymkatalyse ist HMF (und/oder HMFOH). Daher ist dessen kostengünstige Produktion ebenfalls sehr wichtig und wird vom Fraunhofer CBP betrachtet. Der gesamte Prozess - von der Hefeanzucht und der Expression der rekombinanten Enzyme bis zur enzymatischen Umsetzung von HMF/HMFOH zu FDCA - wird einem Scale-up in den technischen Maßstab unterzogen, um die Machbarkeit des entwickelten Prozesses zu demonstrieren.
Das Projekt "Teilprojekt A" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von ASA Spezialenzyme GmbH durchgeführt. 2,5-Furandicarboxysäure (FDCA) ist eine biobasierende Alternative zur petrochemisch produzierten Terephtalsäure, welche zur Herstellung von PET und Polyestern für die Verpackungs- und Textilindustrie verwendet wird. Somit besteht ein großer Markt für diese Plattformchemikalie. Der Fokus des beantragten Vorhabens liegt auf der Entwicklung von maßgeschneiderten Enzymen unter Nutzung der nicht-pathogenen Hefen Arxula adeninivorans und Hansenula polymorpha. Ziel ist die Enzymkatalyse der Reaktion von 5-Hydroxymethylfurfural/5-Hydroxymethylfurfurol (HMF/HMFOH) zu FDCA, eine Nutzung von Roh-HMF direkt aus der Synthese von Zuckern als Substrat (und/oder HMFOH) sowie die effiziente biotechnischen Umsetzung, um einen ökonomischem Gesamtprozess zu ermöglichen. Am IPK werden zwei Ansätze verfolgt: (1) Intrazelluläre bakterielle HMF-Oxidase (HMFO) und (2) gentechnologisch maßgeschneiderte Arylalkoholoxidase (AAOm), sowohl als Ganzzell-Katalyse als auch isoliert/immobilisiert. Der Ansatz mit der höchsten Effizienz wird weiterentwickelt und optimiert. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeiten, die Etablierung eines effektiven und robusten enzymatischen Katalyse-Prozesses wird von ASA durchgeführt. Der zusätzliche innovative Aspekt ist die Nutzung alternativer Substrate. Der Fermentationsprozess wird an verschiedene Zucker aus der Lignozellulose angepasst, die durch den Organosolv-Aufschluss am Fraunhofer CBP produziert werden. Dies ist ein wichtiger Schritt zur Entwicklung eines wirtschaftlichen und nachhaltigen Verfahrens. Das ausgewählte Substrat für die Enzymkatalyse ist HMF (und/oder HMFOH). Daher ist dessen kostengünstige Produktion ebenfalls sehr wichtig und wird vom Fraunhofer CBP betrachtet. Der gesamte Prozess - von der Hefeanzucht und der Expression der rekombinanten Enzyme bis zur enzymatischen Umsetzung von HMF/HMFOH zu FDCA - wird einem Scale-up in den technischen Maßstab unterzogen, um die Machbarkeit des entwickelten Prozesses zu demonstrieren.
Das Projekt "Teilprojekt B" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung durchgeführt. 2,5-Furandicarboxysäure (FDCA) ist eine biobasierende Alternative zur petrochemisch produzierten Terephtalsäure, welche zur Herstellung von PET und Polyestern für die Verpackungs- und Textilindustrie verwendet wird. Somit besteht ein großer Markt für diese Plattformchemikalie. Der Fokus des beantragten Vorhabens liegt auf der Entwicklung von maßgeschneiderten Enzymen unter Nutzung der nicht-pathogenen Hefen Arxula adeninivorans und Hansenula polymorpha. Ziel ist die Enzymkatalyse der Reaktion von 5-Hydroxymethylfurfural/5-Hydroxymethylfurfurol (HMF/HMFOH) zu FDCA, eine Nutzung von Roh-HMF direkt aus der Synthese von Zuckern als Substrat (und/oder HMFOH) sowie die effiziente biotechnischen Umsetzung, um einen ökonomischem Gesamtprozess zu ermöglichen. Am IPK werden zwei Ansätze verfolgt: (1) Intrazelluläre bakterielle HMF-Oxidase (HMFO) und (2) gentechnologisch maßgeschneiderte Arylalkoholoxidase (AAOm), sowohl als Ganzzell-Katalyse als auch isoliert/immobilisiert. Der Ansatz mit der höchsten Effizienz wird weiterentwickelt und optimiert. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeiten, die Etablierung eines effektiven und robusten enzymatischen Katalyse-Prozesses wird von ASA durchgeführt. Der zusätzliche innovative Aspekt ist die Nutzung alternativer Substrate. Der Fermentationsprozess wird an verschiedene Zucker aus der Lignozellulose angepasst, die durch den Organosolv-Aufschluss am Fraunhofer CBP produziert werden. Dies ist ein wichtiger Schritt zur Entwicklung eines wirtschaftlichen und nachhaltigen Verfahrens. Das ausgewählte Substrat für die Enzymkatalyse ist HMF (und/oder HMFOH). Daher ist dessen kostengünstige Produktion ebenfalls sehr wichtig und wird vom Fraunhofer CBP betrachtet. Der gesamte Prozess - von der Hefeanzucht und der Expression der rekombinanten Enzyme bis zur enzymatischen Umsetzung von HMF/HMFOH zu FDCA - wird einem Scale-up in den technischen Maßstab unterzogen, um die Machbarkeit des entwickelten Prozesses zu demonstrieren.
Das Projekt "Nutzung der Biosensortechnik fuer physiologische Untersuchungen und Entwicklung eines BSB-Sensors am Beispiel der Hefe Arxula adeninivorans" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) durchgeführt. Ziel des Projektes ist es, zur Messung von Abwasserbelastungen einen BSB-Sensor auf der Basis der Hefe Arxula adeninivorans LS3 zu entwickeln. Diese Hefe ist hinsichtlich Substratspektrum dem derzeitig kommerziell eingesetzten BSB-Sensor ueberlegen und ermoeglicht damit eine bessere Uebereinstimmung mit dem BSB5. Im Rahmen des Projektes konnte gezeigt werden, dass sowohl die Zellkultivierung als auch das dazu genutzte Medium die Sensor-Signale beeinflussen. So lassen sich bei Einsatz von Maltose anstelle von Glucose als C-Quelle mit diesen A. adeninivorans-Zellen das Spektrum messbarer Substrate vergroessern und meist hoehere Sensorsignale erzielen. Auch die Messtemperatur der Messkammer des ARAS Sensor-BOD-Systems der Dr. Bruno Lange GmbH war bisher fuer den Arxula-Sensor noch nicht optimal. So laesst sich durch Erhoehung der Temperatur von 37 Grad Celsius auf 40 Grad Celsius/42 Grad Celsius die Sensitivitaet des Biosensors auf die meisten Substrate steigern. Noch entscheidender ist der Einfluss der Morphologie der als Biosensorkomponente genutzten A. adeninivorans Zellen auf die erreichten Sensor-Signale. Da diese Hefe eine dimorphe Hefe ist, die bei Kultivierungstemperaturen unter 42 Grad Celsius Hefezellen bildet und ab 43 Grad Celsius als Mycel waechst, bestand erstmals die Moeglichkeit, zwei unterschiedliche morphologische Formen eines Stammes als mikrobielle Sensorkomponente zu testen. Dabei konnten durch die Nutzung von Mycel die Sensor-Signale der meisten getesteten Substanzen erhoeht werden, ohne Verringerung der Messbereiche, der Lagerstabilitaet bzw. der Anzahl der Messungen, die mit solch einem Sensor durchgefuehrt werden koennen. Keinen bzw. nur einen geringen Einfluss auf die Sensor-Signale haben die zur Immobilisierung genutzten Substanzen. Da Arxula adeninivorans eine osmoresistente Hefe ist, wurde ihr Einsatz zur Messung von Umweltbelastungen in Salz-, Meeres- und Brackwasser getestet. Waehrend es bei herkoemmlichen Biosensoren bereits bei sehr geringen Salzkonzentrationen zu physiologischen Veraenderungen des Biosensors kommt, konnte beim Arxula-Biosensor bis zu einer NaCl-Konzentration von 0,5 Prozent (entspricht 10 Prozent NaCl in der Messprobe) nur der durch die veraenderte Sauerstoffloeslichkeit hervorgerufene physikalische Effekt bestimmt werden. Erst hoehere NaCl-Konzentrationen verursachen auch bei diesem Biosensor physiologische Effekte, die zur Veraenderungen der Sensor-Signale fuehren. Bei Nutzung von Hefeextrakt konnte gezeigt werden, dass der durch die NaCl-Zugabe verursachte physiologische Effekt sehr stark von der Konzentration des Substrates abhaengig ist. So korrelieren bei dem Arxula-Biosensor Hefeextraktkonzentrationen bis zu 0,0625 Prozent (entspricht 0,5 Prozent in der Messprobe) direkt mit der NaCl-Konzentration, wobei bis zu dieser NaCl-Konzentration nur der physikalische Effekt nachweisbar ist.
Das Projekt "Neues Wirts-Vektor-System fuer Produktsynthesen in der Hefe Arxula adeninivorans LS 3" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von ADW - Zentralinstitut für Genetik und Kulturpflanzenforschung durchgeführt. Aus Erfahrung mit einem aus Futterhefekulturen neuisolierten Hefe-Stamm der Art arxula adeninivorans LS3 soll ein alternatives, leistungsfaehiges Wirts-Vektor-System aufgebaut werden. Das Projekt konzentriert sich dabei auf die Schwerpunkte: Erkundung von Moeglichkeiten fuer den Gentransfer in LS3 (Aufbau von Vektorplasmiden, Selektionsmarker, Replikatorelementen, Transformation in LS3), Charakterisierung LS3 spezifischer Expressions-Sekretionskassetten (Elemente der Genexpression, der Sekretion und des posttranslationalen Proteinprocessing) fuer heterologe Produktsynthesen, Erkundung sicherheitstechnisch vorteilhafter Loesungen fuer ein nutzbares Wirtssystem auf der Basis von LS3.
Das Projekt "Entwicklung eines innovativen biotechnologischen Verfahrens zur Herstellung bioabbaubarer Polymere durch erstmaligen Einsatz rekombinanter Hefen - Förderschwerpunkt: Biotechnologie" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle, Sektion Umweltmikrobiologie durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Eine kommerzielle Nutzung mikrobiell erzeugter Produkte, wie Polyhydroxyalkanoaten (PHA), im Sinne einer Umweltvorsorge erscheint auf Grund ihrer Eigenschaften, insbesondere wegen ihrer biologischen Abbaubarkeit, und ihrer vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten sinnvoll und notwendig. Sie so preiswert zu produzieren, dass sie in der Konkurrenz mit eingeführten Kunststoffen wie Polypropylen oder Polyethylen bestehen, ist eine große Herausforderung an bio-, natur- und ingenieurwissenschaftliche Disziplinen. Weltweit werden Anstrengungen unternommen, dieses Ziel zu erreichen. Sie bestehen in der weiteren Optimierung vorliegender innovativer Verfahren sowie bekannter bakterieller 'Produzenten' und im Screening nach neuen Produzenten. Dabei stellt sich die Frage, wie gut es gelingt, Organismen, die sich bereits in anderen biotechnischen Prozessen bewährt haben und Vorzüge aufweisen, für die Synthese von PHA durch gentechnische Maßnahmen 'aufzubereiten'. Dazu zählt unter anderem die Backhefe Saccharomyces cerevisiae. Sie zur PHA(B)-Synthese zu befähigen, zu der sie als Wildtyp nicht in der Lage ist, wurde bereits erprobt. Dieser Projektvorschlag favorisiert zwei sog. nicht konventionelle Hefen: Arxula adeninivorans, die molekularbiologisch sehr gut untersucht ist und wofür ein Expressionssystem vorliegt, und die oleogene Hefe Debaryomyces hansenii, letztere, da sie bereits über eine metabolisch-regulatorische Prä-Disposition verfügen dürfte. Aufgabe war es, I) durch transformative Übertragung diese Spezies' zur PHB-Synthese zu befähigen, II) die Expression und Leistung(sfähigkeit) der Transformanten zu analysieren und iii) Methoden zum Aufschluss der Zellen und damit zur Gewinnung von PHA zu erproben. Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden: I): Die einzelnen PHB-Gene von R. eutropha (beta-Ketothiolase, Acetoacetyl-CoA-Reduktase, PHB-Synthase) bzw. das PHB-Synthasegen von M. extorquens wurden sowohl in die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Hefe-Modellsystem als auch in Arxula adeninivorans (als einem Modellobjekt für die heterologe Expression in einem 'Nicht-Saccharomyces-Stamm') und in die Fetthefe Debaryomyces hansenii übertragen und dort exprimiert. Durch Nutzung verschiedener Arxula-Stämme ließ sich ein möglicher Einfluss der Zellmorphologie auf die Produktbildung untersuchen. Für die Expression in Debaryomyces hansenii musste zunächst ein Expressionssystem entwickelt werden. Neben dem Nachweis der Aktivitäten der PHB-Enzyme wurde PHB nachgewiesen. Die Untersuchungen zur Expression in D. hansenii wurden, wie bei A. adeninivorans beschrieben, durchgeführt. Und II): Die Rekombinanten Hefen A. adeninivorans D. hansenii wurden batch wise und kontinuierlich vermehrt und die Produktbildung versucht zu provozieren bzw. zu stimulieren. Die Experimente wurden in Schüttelkolben und in Bioreaktoren (Fermentoren) durchgeführt, nur wenige im 'zig-Liter'-Maßstab. ...
Das Projekt "Gentechnische Untersuchung der Schwermetallionen-Resistenz der Hefe Arxula adeninivorans" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Industrieforschungszentrum Biotechnologie durchgeführt. Schwermetallionenresistenzen werden in Eukaryonten weitgehend durch Metallothioneingene codiert. Diese Gene und Genprodukte sind durch konservierte Sequenzen mit hoher Homologie verwandt. Darauf basierend sollen Metallothionein-Gene der Hefe Arxula Adeninivorans LS 3 indentifiziert werden. Dabei sollen radioaktiv markierte Oligonucleotidproben dieser Sequenzen mit chromosomaler DNA der Hefe aus Adeninivorans LS 3 hybridisiert werden. Mittels PCR-Technikl wird ein Gen kloniert, wobei als spezifischer Primer eine positive Oligonucleotidprobe der Hybridisierung genutzt wird. Die Charakterisierung des Gens erfolgt durch Restriktions- und Sequenzanalyse sowie Transformation des Gens auf einem Vektor in sensible Staemme der Hefen Saccharomyces cerevisiae und Arcula adeninivoraus. Durch entsprechende Vektorkonstruktionen soll die Kopienzahl des Gens und die Resistenz der Hefe erhoeht werden. Die phaenotypische Charakterisierung des Ausgangsstammes und der Transformanten ist vorgesehen.
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