Das Projekt "Teilprojekt 2" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Toxikologie durchgeführt. Die Detektion von Botulinum Neurotoxinen (BoNT) ist aufgrund ihrer hohen Toxizität und der zahlreichen Toxinvarianten (7 Serotypen, mehr als 35 Subtypen) außerordentlich schwierig. Als Goldstandard zur Diagnostik von Botulismus-Verdachtsproben gilt der nach DIN10102 vorgeschriebene Mausbioassay. Hierfür werden nach Schätzungen des RKI pro Jahr in Deutschland 8.000-10.000 Mäuse benötigt. Ziel des Kooperationsprojekts des Robert Koch-Instituts und der Medizinischen Hochschule Hannover ist die Erforschung eines innovativen, hochsensitiven in vitro-Verfahrens zum funktionellen und immunologischen Nachweis aller BoNT-Moleküle aus Realproben und dessen Etablierung, um den Mausbioassay im Rahmen der Botulismusdiagnostik zu ersetzen. Im Projekt werden maßgeschneiderte Bindungsmoleküle konstruiert, um verschiedene Aspekte der funktionellen Aktivität von BoNT in einem Multiplex-Suspensionsarray in vitro zu erfassen. Das Verfahren, das für die Anwendung im mikrobiologisch-klinischen Routinelabor geeignet ist, wird gegenüber etablierten Methoden zur funktionellen Detektion von BoNT prävalidiert. Die Realisierung des Vorhabens stellt einen wichtigen Beitrag zur komplexen Diagnostik von Botulismus dar und wird im Sinne des 3R-Konzepts dazu beitragen, Tierversuche im Bereich Botulismusdiagnostik durch ein in-vitro-Verfahren zu ersetzen.
Das Projekt "Entwicklung eines In-vitro-Testprinzips für die Aktivitätsbestimmung von Botulinumtoxinen zum Ersatz von Tierversuchen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Paul-Ehrlich-Institut, Bundesinstitut für Impfstoffe und biomedizinische Arzneimittel, Abteilung Veterinärmedizin durchgeführt. Die gesetzlich vorgeschriebene Wirksamkeitsbestimmung der als Arzneimittel und Kosmetika hergestellten Botulinum-Neurotoxine BoNT/A und BoNT/B mittels LD50-Test erfordert jährlich über 600.000 Mäuse. Dieser qualvolle Tierversuch soll ersetzt werden. Wir wollen Assays entwickeln, die den Wirkmechanismus der Toxine (Bindung an Neuronen - Translokation in die Zelle - Spaltung neuronaler Proteine) in vitro abbilden. Botulinum-Neurotoxine wirken nach demselben Prinzip wie das Tetanus-Neurotoxin (TeNT). Wir haben bereits eine In-Vitro-Methode zur Bestimmung von TeNT entwickelt, die aktives Toxin anhand seiner Bindungsfähigkeit und Proteaseaktivität nachweist. Diese Strategie soll nun auf BoNT/A und BoNT/B übertragen werden und als Alternativtest dienen. Hierzu müssen zunächst die in dem Test verwendeten Bindungs- und Substratmoleküle an die Rezeptor- und Proteasespezifitäten der jeweiligen Botulinumtoxine angepasst und die Testbedingungen für jedes Toxin umfassend optimiert werden. Danach soll die Transferierbarkeit der Methode in andere Labore geprüft und ein Vergleich mit dem Tierversuch durchgeführt werden. Schließlich soll zur Validierung der Methode ein europäischer Ringversuch initiiert werden. Nach der Validierung wird eine Aufnahme der Methode in das Europäische Arzneibuch angestrebt, um eine breite Anwendung anstelle der LD50-Tests zu erreichen. Zudem soll geprüft werden, ob sich die Methode auch für weitergehende Anwendungen (z.B. Prüfung von Botulismusimpfstoffen) eignet.
Das Projekt "Entwicklung eines BoNT Wirksamkeits-Assays an humanen synaptischen Netzwerken als Alternativmethode zum LD50 Maus Test mittels iPSC-Technologie" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Düsseldorf, Institut für Neuro- und Sinnesphysiologie durchgeführt. Durch Reprogrammierung erzeugte humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) eröffnen neue Möglichkeiten der Entwicklung und Anwendung von in vitro differenzierten Zellkultursystemen. In diesem Projekt wird eine auf der iPSC-Technologie basierende Alternativ-Methode zum LD50-Maustest für die vorgeschriebene Wirksamkeitsprüfung von Botulinumneurotoxin (BoNT) Präparaten entwickelt. In vitro differenzierte menschliche Nervenzellen bilden die Grundlage für einen hochsensitiven und zuverlässigen Assay, der ein möglichst vollständiges replacement des LD50-Maustests ermöglichen soll. Die Kultivierung von aus humanen iPSC differenzierten Neuronen auf multi-electrode-arrays (MEAs) ermöglicht eine kontinuierliche elektrophysiologische Registrierung spontaner synaptischer Netzwerkaktivität. Nach einer pharmakologischen Charakterisierung wird durch Reduktion der extrazellulären Ca2+ Konzentration eine zur BoNT Wirkung vergleichbare Inhibition der synaptischen Funktion erzeugt, um die Sensitivität des Zellsystems zu testen. Mit diesem System werden dann die experimentellen Bedingungen für BoNT Dosis-Wirkungs-Kurven an funktionellen menschlichen Synapsen ermittelt. In einem zweiten Schritt werden die Ergebnisse aus dem MEA System auf ein Ca2+-Imaging-System mit wesentlich einfacherer Datenanalyse übertragen. Mit der Erstellung von BoNT Dosis-Wirkungs-Kurven mittels Ca2+-Imaging wird dann ein neues Alternativ-Verfahren zur Prüfung der BoNT Potenz in einem humanen System etabliert.
Das Projekt "Funktionelle Multiplex-Detektion von Botulinum Neurotoxinen (FuMiBoNT) - Teilprojekt 1" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Robert Koch-Institut (RKI), Fachgebiet Mikrobielle Toxine durchgeführt. Die Detektion von Botulinum Neurotoxinen (BoNT) ist aufgrund ihrer hohen Toxizität und der zahlreichen Toxinvarianten (7 Serotypen, mehr als 35 Subtypen) außerordentlich schwierig. Als Goldstandard zur Diagnostik von Botulismus-Verdachtsproben gilt der nach DIN10102 vorgeschriebene Mausbioassay. Hierfür werden nach Schätzungen des RKI pro Jahr in Deutschland 8.000-10.000 Mäuse benötigt. Ziel des Kooperationsprojekts des Robert Koch-Instituts und der Medizinischen Hochschule Hannover ist die Erforschung eines innovativen, hochsensitiven in vitro-Verfahrens zum funktionellen und immunologischen Nachweis aller BoNT-Moleküle aus Realproben und dessen Etablierung, um den Mausbioassay im Rahmen der Botulismusdiagnostik zu ersetzen. Im Projekt werden maßgeschneiderte Bindungsmoleküle konstruiert, um verschiedene Aspekte der funktionellen Aktivität von BoNT in einem Multiplex-Suspensionsarray in vitro zu erfassen. Das Verfahren, das für die Anwendung im mikrobiologisch-klinischen Routinelabor geeignet ist, wird gegenüber etablierten Methoden zur funktionellen Detektion von BoNT prävalidiert. Die Realisierung des Vorhabens stellt einen wichtigen Beitrag zur komplexen Diagnostik von Botulismus dar und wird im Sinne des 3R-Konzepts dazu beitragen, Tierversuche im Bereich Botulismusdiagnostik durch ein in-vitro-Verfahren zu ersetzen.