Das Projekt "Entwicklung eines innovativen biotechnologischen Verfahrens zur Produktion hochwertiger Kohlenhydrate aus nachwachsenden Rohstoffen durch erstmaligen Einsatz des ext" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Technische Universität Hamburg-Harburg, Arbeitsbereich Technische Mikrobiologie durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Aufgrund seines breiten Substratspektrums nimmt das thermoalkaliphile Bakterium Anaerobranca gottschalkii (vormals bogoriae) eine Sonderstellung unter allen extremophilen Mikroorganismen ein und verfügt über eine Fülle von biotechnologisch interessanten Enzymen. Ziel des Projekts war es, durch den Einsatz von Biokatalysatoren aus diesem Mikroorganismus nachwachsende Rohstoffe wie Stärke bzw. Amylopectin und Amylose zu hochwertigen Kohlenhydraten (Cyclodextrine, verzweigte Dextrine und Oligosaccharide) umzusetzen. Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden: Das Genom des thermoalkaliphilen Bakteriums Anaerobranca gottschalkii wurde zunächst partiell sequenziert. Ziel des Teilprojekts war es, unter geringstem möglichem Aufwand und innerhalb kürzester Zeit alle oder möglichst viele Gene des Kohlenhydratstoffwechsels zu identifizieren. Die partielle Genomanalyse erfolgte über eine so genannte shotgun-Seqenzierung. Dabei wurde die genomische DNA mechanisch geschert, kloniert und an den Fragmentenden sequenziert. In 14.865 Sequenzierungsansätzen wurden 11.634 brauchbare Sequenzen mit einer Rohsequenz von 11,97 Mbp generiert. Die produzierten Sequenzfragmente wurden in einer Datenbank zusammengefasst und assembliert. Anschließend erfolgte die bioinformatische Auswertung über eine automatisch vorgenommene und manuell nachbearbeitete Annotation. Sequenzlücken in biotechnologisch relevanten Genen wurden durch Primerwalking geschlossen. Den Projektteilnehmern wurden Passwortgeschützte Zugangsrechte auf den die Sequenzinformationen enthaltenen Server eingerichtet. Mit Hilfe dieser Sequenzinformation wurden Gene ausgewählter Kohlenhydrat-metabolisierender Gene kloniert und exprimiert und die rekombinanten Enzyme gereinigt. Die Substrat- und Produktspektren dieser Enzyme wurden mittels HPLC, High performance anion exchange chromatography (HPAEC), Dünnschichtchromatographie (DC) und size exclusion chromatography (SEC) charakterisiert. Um die Thermostabilität der CGTase zu erhöhen, wurden über Errorprone PCR Mutationen in das die CGTase kodierende Gen eingeführt und die mutierten Gene anschließend über DNA-shuffling neu rekombiniert. Die Genbank erhaltener, mutierter CGTase-Varianten wurde auf erhöhte Thermostabilität gescreent. Zur Abschätzung der Thermostabilität wurde die Schmelztemperatur verschiedener Mutanten mittels differential scanning calorimetry (DSC) bestimmt. Des Weiteren wurde ein System zur Tat-abhängigen heterologen, sekretorischen Expression etabliert. Dies geschah über die Herstellung von Fusionsgenen aus biotechnologisch interessanten Genen von A. gottschalkii und verschiedenen Signalsequenzen.