Ausgewählte Zielproteine werden einem Kristallisationsscreening unterzogen, wobei Dampfdiffusions- und Microbatchverfahren eingesetzt werden. Davon ausgehend werden Phasendiagramme erstellt (Lichtstreuung und Selfinteraction chromatography). Geeignete Bachbedingungen dienen als Ausgangspunkt für die Hochskalierung im Rührkessel. Der Prozess wird so geführt, dass das Protein quantitativ in die kristalline Phase geht (kontinuierliche Zuführung von Protein oder Fällungsmittel, Vakuumverdampfung). Die Abtrennung der Kristalle erfolgt durch Filtrations- oder Zentrifugationsverfahren.
Ziel des Projekts war es, über Laccase-vermittelte Reaktionen eine umweltfreundliche Synthese von Feinchemikalien vorzunehmen und somit im Rahmen der Weißen Biotechnologie ökoeffiziente Syntheseverfahren zu etablieren. Besonderes Augenmerk fiel hierbei auf die Gewinnung von sekundären Aminen. Dabei fanden Laccasen aus Weißfäulepilzen, direkt aus dem Pilz isoliert sowie rekombinant hergestellt, und rekombinante bakterielle Laccasen in Kopplungsreaktionen ihren Einsatz. Mit Beginn des Projekts erfolgte die Vereinbarung eine enzymvermittelte Synthese von sekundären Aminen anzustreben, um so prinzipielle Reaktionsmuster und -kinetiken für nachfolgende Untersuchungen zu erhalten. Die Beispielreaktion stellt die heteromolekulare Kopplungen eines ortho- bzw. para-dihydroxylierten, alkylsubstituierten aromatischen Laccase-Substrates und diverser aliphatischer Amine dar.
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens:
Aminosäuren sind wirtschaftlich wertvolle Produkte. Dies gilt insbesondere für die eng verwandten verzweigtkettigen Aminosäuren L-Leucin, L-Isoleucin und L-Valin, deren Herstellung einer besonders großen Wertschöpfung unterliegt, und die unter anderem für pharmazeutische Zwecke in allerhöchster Reinheit benötigt werden. Es ist deswegen das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem ausschließlich eine der genannten Aminosäuren gebildet wird, ohne dass andere Aminosäuren oder weitere Nebenprodukte gebildet werden. Dadurch sind erheblich einfachere und somit umwelt- und ressourcenschonendere Aufarbeitungsverfahren nötig, um das reine Endprodukt zu erhalten.
Fazit:
Durch die Arbeiten ist es gelungen, einen umfassenden Einblick in die Funktion und Bedeutung einzelner Transaminasen für die Aminosäurebildung mit Corynebacterium glutamicum zu gewinnen. Es gelang die Substratspezifität der Transaminase AroT zu verändern und die Kristallstruktur der Transaminase HisC zu bestimmen. Ferner gelang es durch genetische Arbeiten zwei Transaminasen auszuschalten und dadurch einen L-Valin Produktionsstamm erheblich zu verbessern. Indem die L-Valinausbeute erhöht wird und zudem weniger von der Begleitaminosäure L-Alanin gebildet wird, ist ein erheblich einfacheres und somit umwelt- und ressourcenschonenderes Aufarbeitungsverfahren erforderlich, um das reine Endprodukt L-Valin in Infusionsqualität zu gewinnen.
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens:
Ein zukunftsweisender Ansatz für die Durchführung von kontinuierlichen und integrierten biotechnologischen Verfahren ist die Einbindung von Hohlfasermodulen in den Produktionsprozess. Diese sind in der Lage, auf einfache Weise die Abtrennung von Produkten oder die Rückhaltung von Verfahrensbestandteilen, wie Zellen oder immobilisierten Biokatalysatoren zu ermöglichen. Ferner lassen sich modifizierte und gezielt funktionalisierte Hohlfasern für die hochaffine Bindung von Metaboliten nutzen. Dies lässt sich für die Isolierung von Wertstoffkomponenten, zur Entfernung qualitätsmindernder Bestandteile und zur Aufreinigung von Rohprodukten ausnutzen. So können integrierte Produktionsabläufe aufgebaut werden, deren ökonomische und ökologische Bilanz durch Ressourcenschonung, durch Verringerung der Produktkontamination, durch Energieeinsparung und durch Minderung der Reststofffrachten im Vergleich zu herkömmlichen Produktionsprozessen erheblich verbessert wird.
Ziel des Projekts ist die Entwicklung funktionalisierter Hohlfasermodule auf Basis der Mikrohohlfaserkassetten für die Bereiche Kultivierung und Downstreaming, um integrierte Prozessabläufe zu ermöglichen, sowie deren Testung und Etablierung an Modellsystemen.
Fazit:
Durch die Aufnahme neuer Arbeitspakete wie die Weiterentwicklung bzw. vollständige Neukonstruktion des MHFRs, die den erfolgreichen Einsatz des Reaktors im Bereich Kultivierung erst ermöglicht haben, konnten die Arbeiten zum weiterführenden Arbeitspaket 7 (Anwendungsbereich Wirkstofftestung) im Rahmen der Projektlaufzeit nicht abschließend bearbeitet werden. Arbeitspakete zur Modifikation der Basismembran zur Anbindung von Liganden sowie der Aufbau und Charakterisierung der funktionalisierten Hohlfasermodule sind vollständig abgeschlossen. Eine Vielzahl verschiedener Oberflächenfunktionalitäten der Hohlfasermembranen wurde generiert und an verschiedenen Targetmolekülen, die von den entsprechenden Mikroorganismen produziert werden, getestet. Weitere Arbeitspakete im Bereich Kultivierung und Downstreaming sind in den letzten Monaten intensiv bearbeitet worden und zeigen vielversprechende Ergebnisse. So liegen nun optimierte MHFR vor, die ein großes Potential für vielfältige Anwendungen zeigen. Durch die ständige Weiterentwicklung des MHFRs konnte die erfolgreiche Kultivierung verschiedenster Mikroorganismen gewährleistet werden.
Des Weiteren sind Strategien zur Aufreinigung und zum Nachweis der entsprechenden Produkte etabliert worden. Durch Kombination dieser beiden Arbeitsaspekte konnte die Option eines integrierten Downstream-Processings erarbeitet werden.