Das Projekt "Untersuchungen ueber den Erbgang von Isoenzym-Mustern und ihre moegliche Eignung als Marker fuer Resistenzgene der Kartoffel" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft durchgeführt. a) Schnellmethode zur Selektion bei der Einkreuzung von Resistenzgenen aus Wildarten zur Pflanzguterzeugung von Kartoffeln. b) Herstellung von Elektropherogrammen von Wildarten, mit den Resistenzgene in die Kulturkartoffel eingekreuzt wurden sowie von Stammbaeumen einiger resistenter Sorten. c) Versuche mit Esteraseisoenzymen; Erweiterung auf einige andere Isoenzyme an gleichen Objekten.
Das Projekt "ICBio: Rekombinante Esterasen für die Feinchemie" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Greifswald, Institut für Chemie und Biochemie, Abteilung für Technische Chemie und Biotechnologie durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Enzymatische Prozesse, insbesondere stereoselektive Hydrolysen und Synthesen gewinnen in der modernen Feinchemie ständig an Bedeutung. Enzymatische Reaktionen können im Vergleich zur chemischen Katalyse häufig unter milderen Bedingungen bezüglich der Verwendung von organischen Lösungsmitteln und solcher Prozessparameter wie Temperatur, Druck und pH-Wert durchgeführt werden. Ein weiterer ökologischer Vorteil von Biokatalysatoren beruht auf der Eigenschaft der Enzyme, eine Vielzahl von Reaktionen stereo- und enantioselektiv zu katalysieren, sodass mehrstufige Synthesen mitunter verkürzt, Ausbeuten gesteigert und Nebenprodukte minimiert werden können. Biokatalytische Prozesse haben also ein erhebliches Potenzial zur Ressourcenschonung und Umweltentlastung. Der erhebliche Zeitdruck (time to market) unter dem neue Prozesse etabliert werden müssen, macht eine lang angelegte Suche nach dem geeigneten Enzym im Vorfeld der Prozessplanung unmöglich. Deshalb geht der Trend zur Vorhaltung einer Sammlung verschiedener Enzyme, die in einem durchmusterungsfähigen Format abgelegt sind. Diese Banken (Kits) lassen sich sehr schnell auf das Vorhandensein eines geeigneten Enzyms untersuchen. Die Nachfrage namhafter Industrieunternehmen nach neuen Esterasen/Lipasen belegt, dass das vorhandene Angebot nicht ausreichend ist. Entsprechend ist es das Ziel des Verbundprojekts und insbesondere der BRAIN AG eine umfangreiche, hochdiverse und charakterisierte Enzymbank aufzubauen, um sich in diesem Marktsegment zu positionieren. Fazit: Im Projektverlauf wurden alle relevanten Methoden zur Erreichung eines wichtigen Ziels des Verbunds etabliert und erfolgreich angewendet: die rasche und zuverlässige Bereitstellung in Bezug auf Substrat-spektrum und Stereoselektivität charakterisierter Enzymbanken. Mit diesem Portfolio sollte eine Realisierung biokatalytischer Verfahren wesentlich vereinfacht sein, da sowohl die Identifizierung geeigneter Enzyme, die zudem rekombinant herstellbar sind, als auch Informationen zur Aktivität und Stereoselektivität verfügbar sind. Für die Schweineleberesterase ist insbesondere durch die optimierte Expression ohne Bildung von inclusion bodies durch Chaperon-Coexpression mit einem Produktionsverfahrens zu rechnen sofern die Probleme in der Maßstabsvergrößerung bei der Hochzelldichtekultivierung gelöst werden können.
Das Projekt "Untersuchungen der Pektinasen der Hefen mit dem Ziel der Nutzung in der Lebensmitteltechnologie, Klaerung der Enzymspektren, der Bildungs- und Regulationsmechanismen. Nutzung von Nebenprodukten der Lebensmittelindustrie als Substrat" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Technische Hochschule Aachen, Institut für Biologie IV (Mikrobiologie) durchgeführt. Der Lebensmittelindustrie stehen auf der Basis von Schimmelpilzen gewonnene Pektinase zur Verfuegung, sie stellen komplexe und zur zum Teil definierte Gemische dar, unerwuenschte Nebenprodukte beschraenken ihren Einsatz (z.B.: Methanolbildung durch Esteraseaktivitaet und Mycotoxine). Es bieten sich Hefen als Produzenten von Pektinasen an, Ziel der geplanten Arbeiten ist die Untersuchung des Pektinasespektrums bei Hefen, der Eignung der Enzyme fuer spezielle Bereiche der Lebensmitteltechnologie sowie Fragen der Enzymisolierung und Charakterisierung. Daran anschliessend sollen sich Arbeiten ueber die Optimierung der Enzymproduktion mit Hefen und Untersuchungen ueber die Nutzung von Nebenprodukten der Lebensmittelindustrie (z.B. Presswaesser, Schlempe, Molke usw.) zur Produktion von Hefepektinasen.
Das Projekt "Entwicklung eines innovativen Verfahrens zur kombinierten Selektion und in vivo Evolution von Esterasen mit dem Ziel der Veränderung ihrer Enantioselektivität am Beispiel der rekombinant in E. coli vorliegenden Esterase aus Pseudomonas fluorescens SIKW1 (PFE-I)" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Greifswald, Institut für Biochemie, Abteilung Biotechnologie und Enzymkatalyse durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Ziel dieses Projekts ist die Veränderung der Substratspezifität von Esterasen gegenüber chiralen Ver-bindungen (Carbonsäuren, Alkohole) mit der Methode der in vivo Evolution. Hierzu stehen mehrere rekombinante Esterasen im Arbeitskreis zur Verfügung (BsubE = Bacillus subtilis Esterase, BsteE = Bacillus stearothermophilus Esterase, BS2 = Esterase aus Bacillus subtilis, SDE = Streptomyces diastatochromogenes Esterase (5, 6) und PLE = Pig Liver Esterase). Der Schwerpunkt soll jedoch auf einer Esterase aus Pseudomonas fluorescens SIKW1 (PFE-I), kloniert in E. coli, liegen. Die gerichtete Evolution von Enzymen ist eine sehr aktuelle Methode, bei der zunächst Mutationen - meist durch eine error-prone PCR - in vitro eingeführt und die daraus resultierenden Mutantenbibliotheken anschließend mittels Hochdurchsatzscreening auf gewünschte Varianten durchmustert werden. Obwohl es eine ganze Reihe eindrucksvoller Beispiele für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode gibt, fehlt jedoch der in der Natur erfolgende evolutive Druck (survival of the fittest). Zur Einführung eines solchen evolutiven Drucks bietet sich die Verwendung des Mutationsstamms oder die Zugabe von chemischen Mutagenen an. Um die Richtung der Mutationen zu beeinflussen, werden dabei speziell ausgewählte Substrate zu einer Kultivierung im Minimalmedium zugegeben. Zum Beispiel kann die Spaltung des einen Enantiomers eine Kohlenstoffquelle liefern, die des anderen ein Antibiotikum oder ein toxisches Produkt freisetzen (Prinzip: Zuckerbrot und Peitsche). Diese Strategie ist der Kern dieses Projekts. Fazit Ein in vivo Selektionssystem zum Auffinden hochselektiver Esterasevarianten gegenüber 3-Phenylbuttersäureestern konnte für eine Positiv- (selektive Esterase, pEST) und eine Negativkontrolle (unselektive Esterase, BS2) etabliert und validiert werden. Die Durchmusterung von durch Sättigungsmutagenese erstellten Mutantenbibliotheken ergab bislang keine selektiveren Enzymvarianten. Die Anwendung einer in vivo Mutagenese (z. B. durch UV-Licht oder chemischen Mutagenen) und die Kombination mit der Selektionsmethode konnte innerhalb der Projektlaufzeit leider nicht erreicht werden.
Das Projekt "Teilvorhaben 2: Auffinden neuartiger Enzyme durch Screening und molekulare Evolution" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Düsseldorf, Institut für Molekulare Enzymtechnologie (IMET) durchgeführt. Ziel des geplanten Vorhabens ist die Optimierung von lipolytischen Enzymen für den Einsatz zur biotechnologischen Produktion von Esterölen. Hierbei steht die Entwicklung von thermostabilen Esterasen bzw. Lipasen mit hohen spezifischen Aktivitäten sowie Prozessstabilitäten bei Temperaturen zwischen 90 und 100 Grad Celsius im Vordergrund. Bei der Durchführung soll zunächst auf vorhandene Enzyme zurückgegriffen werden, die durch gerichtete Evolution an die Prozessbedingungen angepasst werden sollen. Darüber hinaus ist die Identifizierung neuer Enzyme aus dem Metagenom geplant. Die im Rahmen des Projektvorhabens entwickelten Enzyme sollen bei der Firma Goldschmidt AG in die Technologieplattform zur Herstellung hochwertiger Esteröle, ausgehend von nachwachsenden Rohstoffen wie Fettsäuren und Fettalkoholen oder Polyolen, überführt werden.
Das Projekt "Mikrobiologische Sanierung von Boeden eines ehemaligen Huettenstandorts in Saarbruecken-Burbach" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität des Saarlandes, Angewandte Mikrobiologie durchgeführt. Zur Beurteilung zweier biologischer Sanierungsverfahren, die im Rahmen von Pilotversuchen am Standort in Saarbruecken-Burbach durchgefuehrt wurden, wurde das Abbaupotential im Boden bestimmt. Es wurde dabei getestet, ob sich im unbehandelten Erdreich noch vermehrungsfaehige Mikroorganismen nachweisen lassen, und wie aktiv diese sind. In bodenenzymatischen Untersuchungen sollte die Aktivitaet von Esterasen, Dehydrogenasen, Phosphatasen, Sulfatasen und Nitrogenasen bestimmt werden. Der Verlauf der Sanierung wurde mit Schadstoffanalysen (PAK, BTEX) und Toxizitaetstests verfolgt. Beurteilt wurden dabei ein Trockenmieten- und ein Feuchtmietenverfahren. Beide Verfahren waren grundsaetzlich fuer die Sanierung geeignet, solang die Schwermetallkonzentration im Boden gering war. Die Schadstoff-Konzentrationen nahmen waehrend einer Wachstumsperiode bis auf unter 10 Prozent der Ausgangskonzentration ab. Die PAK-Abbauraten erhoehten sich mit steigender Temperatur bis 37 Grad C. Ueber 40 Grad C. war ein starker Rueckgang der Abbauaktivitaet zu beobachten.
Das Projekt "Entwicklung innovativer Mikroreaktoren zur frühen Identifizierung industriell relevanter Enzymreaktionen am Beispiel der Esterase" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität des Saarlandes, Lehrstuhl für Technische Biochemie durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Durch moderne Methoden der Molekularbiologie kann in kurzer Zeit eine Vielzahl von Variationen von Enzymen erzeugt werden, von deren gezieltem Einsatz man höhere Wertschöpfungen bei reduzierter Umweltbelastung erwartet. In diesem Projekt wurden Systeme etabliert, die es gestatten, biokatalytische Reaktionen mit Umsetzung von Sauerstoff und/oder Säure in großer Zahl zu quantifizieren. Dazu wurden Mikrotiterplatten mit integrierter optischer Sensorik entwickelt und mit pH-Regelung sowie einer angepassten Screening-Methodik eingesetzt. Eine Esterase wurde rationell und evolutiv optimiert. Diese wurde mittels eines Autotransporter-Systems in E. coli an der Oberfläche der Zellen exprimert. Das Screening dieser Zellen wird mittels der pH-Sensorplatten durchgeführt. Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden; In einem Projektteil wurden Mikrotiterplatten mit integrierten Optosensoren für Sauerstoff und pH (Messung von Fluoreszenzabschwächung und -abklingzeit) entwickelt. Durch intrinsische Referenzierung sind die Platten kalibrationsarm. Die entwickelten Sensoren wurden charakterisiert anhand der Ansprechzeit, der Reproduzierbarkeit und der Querempfindlichkeit. Die Durchmischung in Mikrotiterplatten wurde durch Analyse von pH-Antworten auf Pulse von Alkali charakterisiert. Enzymatische Reaktionen wurden mittels der immobilisierten Sensoren anhand der pH- oder Sauerstoffänderung beobachtet. Zur Bestimmung kinetischer Parameter wurden geeignete Auswertemethoden unter Einsatz mathematischer Modelle erarbeitet, die für das industrielle Screening geeignet sind. Die Esterase EstA von B.gladioli und eine künstlich erzeugte Esterase EsjA wurden evolutiv variiert zum Einsatz als technischer Biokatalysator. Es geht dabei vornehmlich um die Racematspaltung von Estern. Ein Autotransporter-System in E. coli wurde für die Sekretion von Varianten dieser Esterase genutzt. In Verbindung mit den integrierten Platten und den Screening-Methoden ist eine neue Methode unter Verwendung ganzer Zellen zur schnellen Erzeugung und Testung der katalytischen Aktivität von Enzymen etabliert worden. Fazit: Mit den drei neuen in diesem Projekt entwickelten Mikrotiterplatten mit integrierten Sensoren für pH und Sauerstoff können Enzymkinetiken bestimmt werden. Diese sind in konventionellen Fluoreszenzreadern direkt einsetzbar und benötigen nur einen minimalen Aufwand für die Kalibrierung. Mit diesen Platten konnten umfangreiche Studien zum Mischen und Sauerstofftransport in Mikrotiterplatten durchgeführt werden. Die Platten sind nun kommerziell erhältlich und können auch zum Züchten von Zellen verschiedenster Art eingesetzt werden. Enzyme können mit einem neuen Autotransportersystem in E. coli exprimiert, an die Oberfläche sekretiert und dort aktiv präsentiert werden. Mit diesen Zellen wurden nach molekularer Evolution erste Screening-Tests mit den pH-Platten durchgeführt.
Das Projekt "Auswirkungen des Proteingehaltes der Nahrung auf Wachstum, Ueberleben und Stoffwechselraten junger Steinbuttlarven (Scophthalmus)" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Kiel, Institut für Meereskunde, Abteilung Fischereibiologie durchgeführt. Objective: The aim of the project is to study biotic factors influencing growth and survival rates in newly hatched larvae of Scophthalmus maximus (the significance of protein quality in food organisms commonly used in rearing of turbot larvae will be identified). General Information: The research work will be focussed on the physiology and biochemistry of growth and digestion in young larvae. After commencement of feeding, the quantitative and qualitative aspects of amino acid metabolism and how these promote or influence growth and survival will be examined. Furthermore, the efficiency of the enrichment process for Artemia will be investigated. It is expected to determine the optimum levels of protein enrichment. The factors to be studied will be: protein content; ribonucleic acid (RNA) to deoxyribonucleic acid (DNA) ratio; proteolytic enzyme activity; and amino acid composition. These analytical studies on the effect of feed enrichment will be linked with oxygen consumption measurements to quantify total metabolic activity. Achievements: In order to modify the protein level and/or composition of the rotifers (Brachionus plicatilis) 3 different kinds of microdiets were produced. These microdiets were compared with commercial boosters: Protein-selco (PS), DHA-selco (DHA) and Culture selco (CS). No differences were observed in terms of successful production of rotifers by using these diets. Different treatments tested to modify the total protein level of the rotifers showed no significant differences, but total lipid and total carbohydrate levels responded to the treatments. The copepods were kept on the same algae species as the rotifers (Isochrysis galbana). These copepods used for larval rearing showed the highest protein level of all the tested feeds. The turbot larvae fed on copepods and/or rotifers enriched with a mixture of DHA and PS with a mixture of DHA and the protein enrichment made by the project, Nylon-Protein (NP), showed a marked increase in protein content with age. Larvae fed with DHA enriched rotifers only showed a low increase protein content with age. Growth performance was also the best in those larvae fed on copepods or DHA/PS or DHA/NP enriched rotifers. No differences were found amongst the differently treated groups of larvae concerning lipid and/or carbohydrate content. The composition of the digestive enzymes of the rotifers and of the turbot larvae were different, and might be complementary. In rotifers different feeding regimes produced different enzyme activity patterns. Esterase activity level did not change under different treatments but proteolytic and amylolytic activity level showed differences in the enrichment experiments. The effect of different parental origin on larval performances was tested. For larval protease content no significant differences were found between 47 batches coming from different females. High and variable mortality rates were encountered during the experiments...
Das Projekt "Förderschwerpunkt Biotechnologie: Neuartige Biokatalysatoren aus Basidiomyceten für die Lebensmittelindustrie" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von N-Zyme BioTec GmbH durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Die Einführung moderner Enzymtechnologien in der verarbeitenden Industrie führt zur Substitution umweltbelastender, energieaufwändiger und emissionsreicher chemischer Verfahren und chemisch synthetisch hergestellter Produkte durch ökologisch kompatiblere biotechnologische Alternativen. Der Schlüssel zu einer breiten Etablierung ökonomisch und ökologisch vorteilhafter Prozesse liegt in der Verfügbarkeit hocheffizienter und stabiler Biokatalysatoren. Aufgrund ihrer Befähigung zum Aufschluss lignifizierter Biopolymere besitzen Pilze aus der Klasse der Basidiomyceten eine einzigartige Enzymausstattung. Zu den mehreren hundert potenziellen extrazellulären Basidiomyceten-Enzymen gehören u. a. Glycosidasen, Peptidasen und Lipasen. Ziel des Projekts war es, dieses bisher ungenutzte biochemische Potenzial im Sinne einer Plattformtechnologie für Prozesse und Produkte der weißen Biotechnologie verfügbar zu machen. Dazu zählen die Entdeckung und biochemische Charakterisierung folgender Enzyme: prolinspezifische Peptidasen für den Einsatz in der Getränkeindustrie, Glykosidasen mit neuen katalytischen Eigenschaften ebenfalls zur Verwendung in der Getränkeindustrie, Lipasen und Esterasen für die Aromabiotechnologie, die Wasch-mittel-, Futtermittel- und Lebensmittelindustrie sowie polyvalente Peroxidasen zur Synthese von Fein-chemikalien. Ebenfalls sollte die Eignung der Enzyme für die aufgeführten technischen Zwecke aufgezeigt werden. Fazit: Das Projekt konnte die auf den Vorarbeiten der Universität Hannover beruhende Erwartung, dass Basidiomyceten über eine einzigartige Enzymausstattung verfügen, mehr als bestätigen. Die Identifizierung und Charakterisierung der prolinspezifischen Protease aus W. cocos konnte nahezu abgeschlossen werden, so dass die Produktion im größeren Maßstab sowie die Entwicklung von Verfahren zur Anwendung des Enzyms begonnen werden können. Das Anwendungspotenzial der in L. cochleatus identifizierten ?-1,3-Glucanase muss in weiterführenden Versuchsreihen getestet werden. Ob es sich bei dem in Cyathus striatus entdeckten, zur Anthocyanentfärbung befähigten Enzym um ein erfolgversprechendes handelt, muss sich noch zeigen.
Das Projekt "ICBio: Innovative Aptamer-basierte Proteintestsysteme für medizinische Diagnostik und Katalysatoren für die Entwicklung nachhaltiger Produktionsprozesse" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Leibniz Universität Hannover, Institut für Technische Chemie durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: In diesem Projekt sollen neue Möglichkeiten zur Bereitstellung von Proteinchips für Diagnostik und Proteinscreening dargestellt werden. Das Ziel ist es, zu zeigen, dass Aptamere, die verschiedene relevante Zielmoleküle hochspezifisch und hoch affin in Lösung binden können, auf Chipoberflächen über robuste und universell anwendbare Methoden kovalent und gezielt gekoppelt werden können, dabei ihre Bindungseigenschaften beibehalten und für eine schnelle Proteinanalytik einsetzbar sind. Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden: In den modernen Biowissenschaften besteht ein steigender Bedarf nach Hochdurchsatzmethoden, die eine schnelle, direkte und quantitative Bestimmung von Proteinen ermöglichen. Die Entwicklung geeigneter Techniken, insbesondere von Protein-Microarrays ist jedoch mit Schwierigkeiten verbunden, die insbesondere mit der Diversität der Proteine zusammenhängen. Aufgrund dieser Nachteile haben sich die Antragsteller das Ziel gesetzt, die Wechselwirkung zwischen Aptameren und Proteinen für die Protein-Mikroarray-Technologie auszunutzen. Aptamere sind hoch affine Nukleinsäuren, die an ihre Targetstruktur mit großer Spezifität und Stärke binden, dabei aber durch ihre biochemische Struktur biologisch abbaubare, nicht toxische Substanzen darstellen. Sie sind ausgezeichnete umweltentlastende und ressourcenschonende hochspezifische Erkennungsmoleküle. Im Projekt werden von der RiNA GmbH zwei bereits entwickelte Aptamere hergestellt und zwei neue Aptamere (gegen Insulin und His-tags) entwickelt und zur Verfügung gestellt. Im TCI werden diese vier Aptamersysteme dann zur Herstellung und Testung von Proteinchips (im Vergleich zu konventionellen Antikörperchips) verwendet. Vivascience ist der Partner in der Chipentwicklung (Membranen, Membranchemie) und der Testkit Entwicklung. In allen Projektstufen ist eine klare Abstimmung unter allen Partnern gewährleistet. Die His-getagten Enzyme (Esterasen und eine Alkoholdehydrogenase) werden vom AK Prof. Bornscheuer hergestellt und zur Verfügung gestellt. In Zusammenarbeit mit der DECHEMA wird eine ökologische Bewertung der Testsysteme für das Screening im Produktionsbereich vorgenommen. Fazit: Die wissenschaftlichen Arbeiten innerhalb des Projekts sind abgeschlossen. Die Bereitstellung geeigneter modifizierter Oberflächen sowie Studien zur Immobilisierung verschiedener Aptamere konnten erfolgreich abgeschlossen werden. Es wurden aptamerbasierte Microarrays zur Detektion von His-getagten Proteinen, Streptavidin sowie Daunomycin entwickelt. Dabei konnten medizinisch relevante Konzentrationen detektiert werden
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