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Untersuchungen zur Eignung von Primaerzellkulturen aus der Leber von Fischen zur Pruefung der Toxizitaet von Schadstoffen im Wasser

Das Projekt "Untersuchungen zur Eignung von Primaerzellkulturen aus der Leber von Fischen zur Pruefung der Toxizitaet von Schadstoffen im Wasser" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Heidelberg, Zoologisches Institut I durchgeführt. Vor dem Hintergrund eines moeglichen Einsatzes in Toxizitaetspruefungen werden mit Hilfe isolierter Hepatocyten aus der Leber von Fischen (Primaerzellkulturen) die Uebertragbarkeit von Befunden aus Zellkulturen auf die Verhaeltnisse im intakten Tier untersucht. Im Vordergrund steht dabei die Frage, ob und wie sich Zellen, die der Kontrolle des Organismus entzogen sind, in ihrem Reaktionsspektrum von Zellen gleicher Herkunft, die (in vivo) der organischen Kontrolle unterliegen, unterscheiden. Als Grundlage fuer den Vergleich werden neben klassischen Methoden zur Vitalitaetskontrolle von isolierten Zellen morphologische und biochemische Parameter zur Charakterisierung des Zustandes der Zellen in den Vordergrund gestellt. Als Modell dienen Leberzellen von Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss), deren Ultrastruktur und Biochemie sich in Vorstudien (abgeschlossenen In vivo-Experimenten) als hochsensibles Monitorsystem fuer toxische Einfluesse auf den Fisch erwiesen haben. Ziel der Untersuchung ist es, die Uebertragbarkeit von Befunden an Primaerzellkulturen auf die Reaktion des Gesamttieres zu ueberpruefen und so die Eignung von Primaerzellkulturen (und letztlich Dauerzellinien) fuer den Einsatz zur Pruefung der Toxizitaet von Schadstoffen im Wasser (insbesondere in der Grundstufe und Stufe 1, aber auch der Stufe 2 der Untersuchungen nach Chemikaliengesetz bzw Abwasserabgabengesetz) zu bewerten.

Entwicklung und Erprobung eines in vitro-Testsystems zum Nachweis oestrogener Wirkung von Umweltschadstoffen an primaeren Leberzellen von Karpfen

Das Projekt "Entwicklung und Erprobung eines in vitro-Testsystems zum Nachweis oestrogener Wirkung von Umweltschadstoffen an primaeren Leberzellen von Karpfen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Würzburg, Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften mit Botanischem Garten, Lehrstuhl für Botanik II Ökophysiologie und Vegetationsökologie durchgeführt. Oestrogene Umweltchemikalien induzieren bei Fischen u.a. die Synthese von Vitellogenin in der Leber. Vitellogenin ist ein fuer die Dotterbildung essentielles Phospholipiprotein, das im Normalfall nur von weiblichen Fischen gebildet wird. Unter dem Einfluss oestrogener Umweltchemikalien kann die Vitellogeninsynthese jedoch auch in Maennchen induziert werden, und durch die damit assoziierten Stoerungen im Fortpflanzungsverhalten und -erfolg eventuell das Ueberleben von Populationen beeintraechtigen. Der Nachweis der oestrogen Potenz von Chemikalien kann eindeutiger als im in vivo-Versuch in in vitro-Systemen durchgefuehrt werden. Das FE-Vorhaben hat zum Ziel, ein Kultursystem fuer Leberzellen des Karpfens zu etablieren, und mit Hilfe dieses Systems (a) den initialen Schritt der Vitellogenininduktion, naemlich die Oestradiolrezeptorbindung, und (b) die Vitellogeninsynthese selbst nachzuweisen. In der bisherigen, halbjaehrigen Laufzeit wurden erreicht: (a) Etablierung und Optimierung der Kulturbedingungen fuer die Hepatocyten, (b) Entwicklung eines Radiorezeptorassays zum Nachweis der Rezeptorbindung, (c) Entwicklung eines ELISAs zum Nachweis von Vitellogenin, (d) Bestimmung der Rezeptorbindungskonstanten fuer Nonylphenol, Octylphenol und Bisphenol A, (e) Nachweis der vitellogenininduzierenden Wirkung dar genannten Substanzen.

Teilvorhaben 8: Mikrogelelektrophorese (Comet Assay) mit Fischen und induzierten Fischzellen

Das Projekt "Teilvorhaben 8: Mikrogelelektrophorese (Comet Assay) mit Fischen und induzierten Fischzellen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Heidelberg, Zoologisches Institut I durchgeführt. Ziel des Verbundvorhabens ist die vergleichende Analyse und Bewertung von Indikatortests zur routinemaessigen Erfassung gentoxischer Belastung von Oberflaechengewaessern. Das Teilvorhaben des Zoologischen Instituts Heidelberg ist eingebunden in einen Verbund mit der LfU Baden-Wuerttemberg, Karlsruhe, sowie dem UfZ Leipzig und untersucht Sensitivitaet, Praktikabilitaet und Plausibilitaet des Comet-Assays (Einzelzellgelelektrophorese, Single Cell Gel Electrophoresis, SCE) als Indikatortest fuer die Induktion gentoxischer Veraenderungen/Wirkeffekte in Fischen und Fischzellen. Dazu wird der Comet-Assay fuer den Einsatz mit Zellen aus Fischgeweben optimiert, die Auswertung automatisiert und der Einfluss von Temperatur, Alter, Geschlecht und Vorbelastung erfasst. Die geplanten In vitro-Methoden sollen v.a. als Screening-Tests eingesetzt werden. Die Ganztierexperimente werden im Rahmen des allgemeinen Probenprogrammes exemplarisch an ausgewaehlten Proben durchgefuehrt und dienen der Verifizierung der In vitro-Befunde (Vergleich von Empfindlichkeit und Praktibilitaet). In den Tests werden die Fische bzw. Fischzellen mit definierten Modellsubstanzen sowie nativen und aufkonzentrierten Proben von Oberflaechenwasser aus bekanntermassen belasteten und unbelasteten Gewaessern belastet. Darueber hinaus werden die Fische in Zusammenarbeit mit der LfU an ausgewaehlten Messstellen in situ exponiert. Vergleichend werden isolierte Hepatocyten aus der Leber beta-naphthoflavoninduzierter Regenbogenforellen im Comet-Assay in vitro exponiert und untersucht. Die In vitro- und In vivo-Befunde an Fischen und Fischzellen werden mit Ergebnissen aus dem Comet-Assay mit unstimulierten Primaerkulturen von Fischhepatocyten und permanenten Zellkulturen aus Fischen (UfZ Leipzig) sowie Muscheln und Muschelzellen (LfU, Karlsruhe) verglichen.

Zellulaerer Transport alimentaerer Xenobiotika und ihre Wechselwirkung mit biologischen Membranen

Das Projekt "Zellulaerer Transport alimentaerer Xenobiotika und ihre Wechselwirkung mit biologischen Membranen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Gießen, Institut für Veterinär-Physiologie durchgeführt. Ziel des Forschungsvorhabens ist es, den zellulaeren Transport ausgewaehlter alimentaerer Cancerogene und Mutagene in den Epithelien von Duenndarm und Niere sowie in Hepatocyten zu charakterisieren. Diese Zellen sind entscheidende Stellglieder in der Regulation der Xenobiotikabelastung des Koerpers, wobei sie aufgrund ihrer Funktionen auch einer besonders hohen Fremdstoffbelastung ausgesetzt sind. Diese wuerde zwangsweise zu mutagenen Veraenderungen und zu Transformationen fuehren, wenn nicht spezifische Exportmechanismen zur Absenkung der zellulaeren Konzentration von Wirkstoffen vorhanden waeren. Insbesondere das 'Multidrug-resistence Gene- Product'(MDR-1 oder gp-170), welches in der luminalen Membran von Enterocyten und Tubuluszellen, sowie der canaliculaeren Membran von Hepatocyten nachgewiesen wurde, scheint dafuer verantwortlich zu sein. Das MDR-1 Genprodukt ist eine ATP-abhaengige Exportpumpe, die u. a. eine Reihe von antineoplastischen Pharmaka transportiert. Inwieweit gp-170 auch Xenobiotika dietaetischen Ursprungs als 'natuerliche' Substrate transportiert, ist nicht geklaert. Dies soll als Schwerpunkt im Rahmen des Vorhabens geprueft werden. Darueber hinaus soll ein Testsystem entwickelt und etabliert werden, das es erlaubt, die Wirkung von Xenobiotika auf Ionenkanaele und damit die normale Transportfunktion der biologischen Membran zu untersuchen. Das Forschungsvorhaben ist in folgende Teilprojekte mit spezifischen Fragestellungen untergliedert: a) Was sind die Mechanismen, mit denen alimentaere Xenobiotika in Enterocyten, Tubuluszellen und Hepatocyten aufgenommen werden? b) Ist das MDR-1 Genprodukt(gp-170) als ATP- abhaengige Effluxpumpe fuer den Ruecktransport der aufgenommenen Fremdstoffe aus den Zellen in das Lumen verantwortlich? c) Inwieweit wird gp-170 nach Verabreichung alimentaerer Carcinogene und Mutagene in Epithelzellen und Hepatocyten ueberexprimiert und fuehrt dies zu einer erhoehten Transportleistung fuer den ATP-abhaengigen Efflux der Fremdstoffe aus den Zellen? d) Inwieweit sind die an isolierten Membranen gewonnenen Erkenntnisse auf dieser Ebene der Reintegration als zentrales Stellglied in der Fremdstoffhomoeostase identifiziert werden? e) In welchem Umfang und wie beeinfussen Xenobiotika den Ionentransport an biologischen Membranen und kann diese Wirkung als Indikator fuer die Cytotoxizitaet eines Fremdstoffes genutzt werden?

Perifusionskulturen von Hepatocyten zur Pruefung von Umweltchemikalien auf Toxizitaet, Mutagenitaet und Cancerogenitaet

Das Projekt "Perifusionskulturen von Hepatocyten zur Pruefung von Umweltchemikalien auf Toxizitaet, Mutagenitaet und Cancerogenitaet" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Tübingen, Physiologisch-Chemisches Institut, Lehrstuhl Biochemie,Physiologische Chemie II durchgeführt. Um Umweltchemikalien einfach und kostenguenstig unter Beruecksichtigung der metabolischen Aktivierung auf Mutagenitaet und Cancerogenitaet testen zu koennen, muss bei der Kultivierung von Hepatocyten die Aktivitaet der fremdstoffmetabolisierenden Enzymsysteme ueber einen langen Zeitraum stabil gehalten und die Handhabung der Kulturen vereinfacht werden. Dies soll durch Co-Kultivierung von Hepatocyten mit geeigneten epitheloiden Zellinien in Kombination mit einem Perifusionssystem erreicht werden, das zusaetzlich die Inkubation mit physiologisch relevanten, konstant niedrigen Subtratkonzentrationen ermoeglicht. An den durch Wahl geeigneter hormoneller Bedingungen und Indiktoren optimierten Kulturen werden Fremdstoffmetabolismus und DNS-Reparatur gemessen. Unter Ausnutzung der Moeglichkeit zur Langzeitkultivierung wird nach geeigneten Bedingungen gesucht, die ein klonales Wachstum In vitro initiierter Hepatocyten beguenstigen.

Einfluss von cyclischem Adenosinmonophosphat und Inositoltriphosphat mobilisierenden Rezeptoragonisten auf den Metallothioneingehalt von primaeren Rattenhepatocytenkulturen

Das Projekt "Einfluss von cyclischem Adenosinmonophosphat und Inositoltriphosphat mobilisierenden Rezeptoragonisten auf den Metallothioneingehalt von primaeren Rattenhepatocytenkulturen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Gießen, Fachbereich 19 Ernährungs- und Haushaltswissenschaften, Institut für Tierernährung und Ernährungsphysiologie durchgeführt. Am Modell primaerer Rattenhepatocyten werden biochemische Einfluesse auf den Zinkmetabolismus und die Synthese von Metallothionein studiert und mit in vivo-Befunden verglichen. Das Forschungsprojekt soll gleichzeitig einen Beitrag zur Frage der Uebertragbarkeit von an Zellkulturen gewonnenen Ergebnissen auf den tierischen Gesamtorganismus leisten.