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Fischsterben in der Jagst

Nach einem Großbrand in Kirchberg im Kreis Schwäbisch Hall am 22. August 2015 gelangte verunreinigte Löschwasser der Feuerwehr in die Jagst, wodurch ein Fischsterben ausgelöst wurde. Von dem Brand in einer Mühle war auch ein Gebäude betroffen, in dem größere Mengen Düngemittel gelagert waren. Nach Angaben eines Polizeisprechers habe sich Ammoniumnitrat aus Düngemitteln mit dem Löschwasser gemischt, das in die Jagst gelangte. Nach Behördenangaben war die Konzentration des Ammoniumnitrat im Wasser am 23. August stellenweise zweihundert Mal höher als die ohnehin schon tödliche Dosis für Fische. In Folge davon ist im Bereich Kirchberg der komplette Fischbestand in der Jagst verendet. „Die Jagst ist eines der wertvollsten Ökosysteme, das wir in Baden-Württemberg haben. Daher sind wir sehr besorgt über den durch das Ammoniumnitrat ausgelösten Schaden“, sagte Naturschutzminister Alexander Bonde. Von den Auswirkungen der Gewässerverunreinigung sind insgesamt fünf FFH- und ein großflächiges europäisches Vogelschutzgebiet sowie einzelne Naturschutzgebiete betroffen. Die aus europäischer Sicht relevanten Arten sind die Kleine Flussmuschel, die Fischarten Bitterling und Groppe sowie der Eisvogel. Der Eisvogel ist mittelbar betroffen, da durch den Wegfall der gesamten Fischpopulation in der Jagst ein Großteil seiner Nahrungsgrundlage entfällt.

Genetische Komponenten für Strahlenempfindlichkeit - Genexpression in strahlenempfindlichen eineiigen Zwillingen - Vorhaben 3604S04460

Ausgangpunkt dieses Projektes war die Hypothese, wonach die Variation der individuellen Strahlenempfindlichkeit auf die unterschiedliche Expression einzelner Gene zurückzuführen ist. Diese These wurde anhand von 60 eineiigen Zwillingspaaren getestet und anschließend in einem zweiten Schritt mit 80 Prostatatumorpatienten überprüft. Die Strahlenempfindlichkeit wurde mit Hilfe chromosomaler Assays sowohl für die G0- als auch die G2-Phase bestimmt. Mit der G0-Strahlenempfindlichkeit wird vor allem die letale Schädigung der Zellen erfasst und damit das individuelle Ausmaß hinsichtlich Zellabtötung, mit der G2-Strahlenempfindlichkeit dagegen z.T. auch die genomische Instabilität der Zellen und damit das individuelle Krebsrisiko. Beide Populationen zeigen hinsichtlich der G0- bzw. der G2-Strahlenempfindlichkeit deutliche Variationen mit einem CV von 11 und 14% bzw. 27 und 21%. Die mittlere G0-Strahlenempfindlichkeit ist in beiden Populationen nahezu identisch, während sich für die G2-Strahlenempfindlichkeit kleine Unterschiede zeigen. Die im Mittel etwas höhere G2-Empfindlichkeit der Prostatapatienten wird vor allem auf das im Mittel höhere Alter dieser Gruppe zurückgeführt. Für beide Populationen wurden die Genexpressionsprofile mittels des Affymetrix-Chips HG-U133+ 2.0 bestimmt. Insgesamt, über alle Gene betrachtet, variierte die Genexpression über 4 Dekaden, wobei allerdings für einzelne Gene nur eine sehr geringe Variation mit einem CV von nur 2 bis 8% gefunden wurde. Unterschiedliche Analyseverfahren ergaben, dass weder für die G0- noch die G2- Strahlenempfindlichkeit die individuellen Unterschiede auf die unterschiedliche Expression einzelner Gene zurückgeführt werden kann. Zwar können für die Zwillingsproben mit Hilfe von Zufallswäldern jeweils 8-10 Gene identifiziert werden, die für die Variation der G0- bzw- G2-Strahlenempfindlichkeit verantwortlich sind. Diese Ergebnisse können allerdings bei der Evaluation mit 80 Prostatapatienten nicht bestätigt werden. Damit kann diese Studie aufgrund der Evaluation eindeutig zeigen, dass die Ausgangshypothese, wonach die Strahlenempfindlichkeit durch die Expression einzelner Gene bestimmt wird, abzulehnen ist. Es ist vielmehr davon auszugehen, dass diese Parameter von der komplexen Interaktion mehrerer Gene innerhalb funktioneller Netzwerke bestimmt werden. //Summary// The underlying hypothesis of this project was that the variation of individual radiosensitivity is determined by the different expression of single gens. This concept was tested using 60 monozygotic twin pairs, followed by an evaluation with 80 prostate cancer patients. Radiosensitivity was assessed for both G0- as well as G2-phase using chromosomal assays. G0- radiosensitivity is determined by lethal chromosomal aberrations and reflects the individual amount of cell killing, while G2-sensitivity is determined by chromatid breaks and is taken as an indicator of individual cancer risk. For both populations, G0- and G2-radiosensitivity are characterized by substantial variation with a CV of 11 and 14% or 27 and 21%, respectively. While the mean G0-sensitivity is the same for both populations, there is a slight difference for G2. The slightly higher value of G2-sensitivity found for prostate cancer patients might result from the higher age of this group. For both populations gene expression profiles were determined using the Affymetrix chip HG-U133+2.0. Overall gene expression was characterized by a huge variation covering more than four decades. However, for single genes, expression showed little variation with CV generally ranging only between 2 and 8%. Analysis of data using several different methods revealed that variation of both G0- as well as G2-radiosensitivity cannot be ascribed to the different expression of single genes. For twins, random forests can be used to identify 8 to 10 genes than are relevant either for G0- or G2-radiosensitivity. However, these genes cannot be confirmed by an evaluation with 80 prostate cancer patients. This finding clearly demonstrates that the hypothesis, due to which variation of individual radiosensitivity is caused by different expression of single genes, has to be rejected. It appears more likely that this parameter is determined by complex interactions of several genes in functional networks.

UV-B-Wirkungen auf Zooplankton

Das Projekt "UV-B-Wirkungen auf Zooplankton" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität München, Zoologisches Institut, Limnologische Abteilung durchgeführt. Bevorzugte Untersuchungsobjekte waren herbivore Planktoncrustaceen: die in Seen lebende Daphnia galeata (=D.g.) und die in Gebirgstuempeln lebende Daphnia pulex obtusa (=D.p.o). Durch die Funktion als Mikroalgenfiltrierer nimmt D.g. in ihrem Lebensraum eine Schluesselposition ein. Ihre Elimination haette fatale Folgen fuer das Seeoekosystem. Zumindest zwischen Mai bis Juli hat D.g. im Gegensatz zu D.p.o. (ca. 80 Prozent tolerieren eine Dosis groesser 60 kJ/m2) keine Chance, innerhalb einer 2 cm-Wasserschicht nach Ueberschreiten von ca. 53 kJ/m2 zu ueberleben. Die empfindlicheren Jugendstadien werden durch UV-B-Dosen um 35 kJ/m2 getoetet. UV-B-Dosen kleiner 20 kJ/m2 fuehren bei erwachsenen D.g. zu diversen Wirkungen, die insgesamt das Populationswachstum vermindern. Das Maximum der UV-B-Wirkung liegt bei 260 nm, das Maximum der 'reparaturwirksamen' Strahlung (Blauviolettlicht) bei 430 nm. D.p.o. erweist sich gegenueber D.g. hinsichtlich ihrer Faehigkeit, durch UV-B hervorgerufene Schaedigungen zu reparieren, als deutlich ueberlegen. Die Reparaturfaehigkeit bleibt nach Abschluss der UV-B-Strahlung noch mindestens 2 Stunden erhalten. Durch Melaninanreicherung wird die UV-B-Vertraeglichkeit ebenfalls erhoeht. Die Synthese des Melanins ist zu Lasten der Reproduktion mit metabolischen Kosten verbunden. Sichtbare Pigmente gefaehrden die Existenz der Daphnien in fischreichen Gewaessern. Aus Expositionen verschiedener Arten in verschiedenen Wassertiefen ergibt sich eine Reihung aufgrund unterschiedlicher Empfindlichkeit gegenueber UV-B. Letale UV-B-Wirkungen sind in schwach mesotrophen Seen zumindest im Juni an sonnigen Tagen (Bewoelkung kleiner 3/10) bis in Tiefen um 20-25 cm moeglich. In oligotrophen Seen sind letale Dosen bis in ca. 2 m Tiefe moeglich, in meso-eutrophen Seen nur innerhalb weniger Dezimeter unter dem Wasserspiegel. Mehrtaegige Expositionen in 'enclosures' fuehren zu Abundanzminderungen bis in 60 cm Tiefe, die nicht nur auf letalen Wirkungen, sondern auch auf einer Verminderung des Populationswachstums beruhen. D.g. ist in der Lage, UV-B wahrzunehmen und zur Orientierung waehrend der tagesperiodischen Vertikalwanderung zu nutzen. Indem sich die Plankter tagsueber in Tiefen groesser 5 m aufhalten, befinden sie sich weit ausserhalb der Grenzen, innerhalb derer Gefaehrdungen bisher nachgewiesen worden sind. Es gibt Hinweise, wonach hohe Dosisraten auch schon bei relativ kurzer Dauer in ihrer Wirkung nicht vernachlaessigbar sind.

Holzschutz-Hygiene-Untersuchungen ueber die schaedliche Einwirkung auf Mensch und Tier, die laetale Dosis usw.

Das Projekt "Holzschutz-Hygiene-Untersuchungen ueber die schaedliche Einwirkung auf Mensch und Tier, die laetale Dosis usw." wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Deutsche Gesellschaft für Holzforschung durchgeführt. Im Rahmen der Arbeit des Arbeitsausschusses: 'Holzschutz-Hygiene' der DGfH sollten Untersuchungen zur Ermittlung der akuten Toxizitaet einer Reihe Holzschutzmitteltypen bei Maeusen nach oraler Verabreichung an Hand der Festlegung der LD 50-Werte durchgefuehrt werden.

Auswirkungen von Dioxinen auf Tiere im Suesswasser-Oekosystem

Das Projekt "Auswirkungen von Dioxinen auf Tiere im Suesswasser-Oekosystem" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Tübingen, Zoologisches Institut, Lehrstuhl Spezielle Zoologie durchgeführt. Erster Abschnitt (1.10.89-31.12.91): a) Auswirkungen von TCDD auf die Oogenese laichbereiter Weibchen von Brachydanio (Laicherfolg, Befruchtungsrate, Ontogenese); b) Auswirkungen einer Kontamination von Eiern und Embryonen; c) Aufnahme, Verbleib und Ausscheidung von TCDD (radioakt mark Substanz) an laichenden Fischen; d) Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme (P-450) nach Belastung adulter Brachydanio mit TCDD. Zweiter Abschnitt (1.1.-31.12.92): a) Weitergabe von TCDD ueber Fischnaehrtiere an Fische; b) Auswirkungen von TCDD auf die Spermiogenese, Befruchtungsrate und Verhalten der Spermien; c) Pruefung eines moeglichen Biomonitoring (Induktion P-450) an Fischen aus verschiedenen Teilen des Landes. An Zebrabaerblingen wurden die toxischen Auswirkungen von 2,3,7,8-TCDD auf die Fortpflanzung und Oogenese untersucht. Die Fische erhielten mit der Nahrung jeweils 1,5,10 oder 20 ng/Fisch verabreicht. Bei Konzentrationen von mehr als 5 ng war das Ablaichen stark beeintraechtigt oder wurde ganz eingestellt. Die Zahl der abgelegten Eier sank stark ab. Die behandelten Weibchen zeigten ein wasting-syndrom (vermindertes Koerpergewicht). Bei den Embryonen entstanden letale Anomalien (100 Prozent Mortalitaet). Die Entwicklung reifer Oozyten unterblieb und die Zahl der atretischen Follikel nahm zu. Die Elimination und Verteilung von (3H)-TCDD in en Organen und Geweben des Zebrabaerblings wurde ueber eine Zeitspanne von 70 Tagen ermittelt. Waehrend in allen anderen Organen Belastungsmaxima nach 1 bis 8 Tagen erreicht wurden mit nachfolgender Elimination, stieg die Belastung der Ovarien bis zum siebzigsten Tag stetig an und erreichte ein Drittel der Gesamtbelastung des Fisches. Diese Belastung wurde abgebaut ueber die Gelege; nach 4 Gelegen hatten die Fische ca 50 Prozent der Belastung abgegeben. Bei TCDD-Konzentrationen von 1,5 und 15 ng/Fisch kam es zu zahlreichen 'Gelegeausfaellen'. Als Ursache werden Stoerungen der Oogenese durch TCDD vermutet. Untersuchungen zum Fremdstoffmetabolismus zeigten, dass Zebrabaerblinge auf TCDD mit einer starken Induktion des Cytochrom P450-Isoenzyms LM4B reagieren. Dies wurde in aehnlicher Weise schon mit verwandten Verbindungen bei anderen Fischarten beobachtet. Die Weitergabe von (3H)-TCDD in der Nahrungskette wurde in einem Modellversuch geprueft. Dazu wurde verwendet: Kontaminiertes Fallaub der Schwarzerle, Bachflohkrebse, die sich von diesem Fallaub ernaehren, und junge Regenbogenforellen, die diese Krebschen gezielt fingen. Die Ergebnisse zeigen, dass es ueber die ausgenommenen Fischnaehrtiere rasch zu einer Anreicherung von TCDD im Organismus kommt. Die Verteilung im Fischkoerper entspricht bereits innerhalb von 8 Tagen der Verteilung nach langfristiger und unterschiedlicher Exposition. Die Ergebnisse sind von Bedeutung fuer die Bewertung der Dioxinwirkung: Die gemessenen Wirkkonzentrationen liegen um mehrere Groessenordnungen unter den bekannten Lethalkonzentrationen...

Untersuchungen zur Wirkung der UV-B-Strahlung auf kleine Wassertiere

Das Projekt "Untersuchungen zur Wirkung der UV-B-Strahlung auf kleine Wassertiere" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität München, Zoologisches Institut, Limnologische Abteilung durchgeführt. Untersuchungen zur Wirkung der UV-B-Strahlung auf kleine Wassertiere. Aquatische Gebirgsorganismen - insbesondere aus FLachwasserbiotopen - sind gegenueber ihren Verwandten in Tieflandseen auffaellig gefaerbt. Dieses Phaenomen fuehrte zu der Hypothese, dass die pigmentierten Tiere vor UV-Strahlung geschuetzt seien. Aufgrund bisheriger Untersuchungen ist erwiesen, dass zumindest ein Vertreter der in Gebirgstuempeln lebenden Cladoceren; (Daphnia pulex Obtusa) eine wesentlich hoehere UV-Toleranz besitzt, als seine Verwandten in Tieflandgewaessern. Es ist zur Zeit nicht bekannt, ob dieser Unterschied auf die unterschiedliche Faerbung zurueckzufuehren ist. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die mittlere letale Dosis (DLM) bei Applikation kurzwelliger sichtbarer Strahlung nach erfolgter UV-Bestrahlung bei allen bisher getesteten Cladoceren erheblich hoehere Werte erreicht.

Short-term effects of air pollution on health: a european approach to methodology, dose response assessment and evaluation of public health significance

Das Projekt "Short-term effects of air pollution on health: a european approach to methodology, dose response assessment and evaluation of public health significance" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Didier-Werke, Anlagentechnik durchgeführt. General Information: In the context of recent publications from North America, indicating that moderate and low levels of air pollution have measurable short-term effects on mortality and morbidity, and the concern caused in the public and regulatory bodies, the APHEA (Short-term effects of Air Pollution on Heath: a European Approach) project investigated the issue in 15 European cities, within the Environment 1991-94 Programme. The combined analyses showed that particulate matter, SO2 and ozone were associated with statistically significant increases in total and cause specific daily mortality (an increase of 50 kg/m3 in one pollutant level was associated with 1-5 per cent increase in mortality). Particulate matter and ozone levels were found associated with hospital respiratory and COPD admissions (a 50kg/m3 increase in the pollutant level was followed by a 1-4 per cent increase in the daily number of admissions) while NO2 levels appeared associated with the number of asthma admissions. Other interesting results referred to regional differences and effect modification by season and by other pollutants. The present proposal has four objectives: 1. To investigate dose-response curves for air pollutants (particulate matter, SO2,NO2,Ozone, CO) -mortality (total, cardiovascular and respiratory) associations in 32 European cities/areas and air pollutants-hospital respiratory admissions in 7 areas, spread in 17 countries; 2. To address the problem of mortality displacement (i.e. how premature are the deaths caused by air-pollution) which is particularly important for evaluating the public health significance of the short-term air pollution health effects; 3. To investigate further regional differences in air pollutants- health associations; and 4. To evaluate results from Europe together with those from the U.S. in collaboration with a starting similar U.S. project. Extended and updated data files (up to 1995 or 96) will be used. The project is structured in Work Packages. In the initial stage (6 months) all Partners will compile their data files and send them to the four Partners who will be responsible for the analyses of individual data sets (13 months) and for the different aspects of the joint analyses (8 months). The next stages will be a collaboration with U.S. researchers (4 months) and the preparation of Reports and manuscripts (5 months). The project will be managed by a Steering Committee, while a Statistical group will be formed to decide on methodological aspects. The total duration of the project will be 36 months with a probable starting date 1/10/97. It is expected that the results will provide important input for public health protection policies and regulations concerning air quality. Prime Contractor: National and Kapodistrian University of Athens, Medical School, Department of Hygiene and Epidemiology; Athens-Goudi; Greece.

Entwicklung von Ersatzmethoden fuer den akuten Fischtest

Das Projekt "Entwicklung von Ersatzmethoden fuer den akuten Fischtest" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Forschungsverbund Berlin, Leibniz-Institut für Gewässerökologie und Binnenfischerei durchgeführt. Jaehrlich werden in der BRD hunderttausende Fische zur Ermittlung der akuten Toxizitaet von Chemikalien und Abwaessern eingesetzt und getoetet. Diese Versuche sind fuer die Fische mit erheblichen Leiden verbunden. Das Ziel dieser Tests ist die Bestimmung der mittleren letalen Konzentration (LC 50) oder einer Abwasserverduennungsstufe (G). Von verschiedenen Forschungseinrichtungen wird deshalb nach Ersatzmethoden gesucht, um akute Fischtests durch alternative Methoden zu ersetzen. Im Zuge der Bemuehungen wurden Fischzellkulturtests entwickelt. Diese Zellkulturtests besitzen jedoch den Nachteil einer mangelhaften Uebertragbarkeit der erzielten Ergebnisse (Lange et al 1995). Zellkulturen repraesentieren nur einen Zelltyp mit seinen metabolischen und physiologischen Leistungen. In Toxizitaetstests reagieren Zellkulturen oftmals sehr unempfindlich auf eine Exposition. Im Forschungsverbund mit dem Zoologischen Institut der Universitaet Mainz und dem Fraunhofer-Institut fuer Oekotoxikologie und Umweltchemie Schmallenberg entwickelte die Abteilung Fischzucht und Fischpathologie des IGB einen Fischeitest, der geeignet erscheint, den akuten Fischtest nach dem Chemikaliengesetz zu ersetzen und dem groessere oekotoxikologische Relevanz als den akuten Toxizitaetsstudien zukommt. Fischpopulationen werden durch die Beeinflussung der Reproduktion geschaedigt. Dies erfolgt von der Anlage der Gameten ueber die Eiablage bis hin zur Beeintraechtigung des Nachwuchses. In aquatischen Oekosystemen werden insbesondere die empfindlichen Lebensstadien von Fischen (Embryonen und Larven) durch biotische, abiotische und anthropogene Stressoren beeinflusst. Der Ueberlebensaussicht von Laich und Brut kommt grosse Relevanz fuer die Vitalitaet und die Struktur der Fischpopulation zu. Die Empfindlichkeit von Probanden gegenueber Chemikalienbelastung in oekotoxikologischen Studien ist ua von dem untersuchten Organismus abhaengig. Ergebnisse aus Toxikologietests mit einer Art sind nicht ohne Einschraenkungen auf andere Spezies uebertragbar. Da es jedoch unmoeglich ist, alle Arten eines Oekosystems in die Stoffbeurteilung einzubeziehen, werden Modellorganismen eingesetzt. Diese muessen aus Gruenden der Praktikabilitaet und einer moeglichst hohen Vergleichbarkeit der gewonnenen Ergebnisse folgenden Kriterien entsprechen: ganzjaehrige Verfuegbarkeit, geringe circadiane Rhythmik, kurzer Generationszyklus, hohe Reproduktionsrate, einfache Haltung und Aufzucht unter Laborbedingungen, gute Beobachtbarkeit und schnelle Entwicklung. Innerhalb aquatischer Oekosysteme werden neben Vertretern anderer Staemme (Arthropoden, Mollusken, Anneliden) bevorzugt Teleosteerarten untersucht. Die oben aufgefuehrten Kriterien zur Auswahl eines Modellorganismus werden nur von wenigen Fischarten erfuellt. Der Zebrabaerbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan) vereint alle aufgezeigten Eigenschaften und wurde deshalb fuer die Untersuchungen ausgewaehlt. Die Art wird desweiteren zunehmend in ...

Entwicklung von Testverfahren an marinen Arten fuer oekotoxikologische Untersuchungen nach dem ChemG - Bryozoen/Kamptozoen

Das Projekt "Entwicklung von Testverfahren an marinen Arten fuer oekotoxikologische Untersuchungen nach dem ChemG - Bryozoen/Kamptozoen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Stiftung Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung in der Helmholtz-Gemeinschaft, Biologische Anstalt Helgoland (Institut BAH) durchgeführt. In Laborexperimenten wurden die Kamptozoe Barentsia matsushimana und die Bryozoe Bowerbankia gracilis auf ihre Eignung untersucht, als marine Testorganismen zu dienen. Die Keimfaehigkeit der Dauersporen und das Wachstum erwiesen sich als ideale Testparameter. Der Keimfaehigkeitstest ist ein subletaler Kurzzeittest von 14 Tagen Dauer, der in natuerlichem und kuenstlichem Seewasser durchgefuehrt werden kann. Mit Kaliumdichromat und 4-Nitrophenol liefert er Ergebnisse im mg 1 hoch minus 1-Bereich. Deutlich empfindlicher ist der auf 7 Wochen konzipierte Wachstumstest, der mit B. matsushimana durchgefuehrt wurde. Dieser Test liefert neben einer mittleren effektiven Konzentration, die eine 50 prozentige Wachstumshemmung anzeigt, einen Wert fuer eine minimal effektive Konzentration (EC tief m). Konzentrationen oberhalb dieses Wertes bewirken eine signifikante Verschlechterung des Wachstums. EC tief m-Werte mit Kaliumdichromat und 4 Nitrophenol liegen im My g l hoch minus 1-Bereich. Beide Tests ergaenzen sich in ihrer Aussage.

Bestimmung von Pflanzenschutzmittelrückständen in Lebensmitteln und Wasser mittels LC-MS/MS und LC-MSn

Das Projekt "Bestimmung von Pflanzenschutzmittelrückständen in Lebensmitteln und Wasser mittels LC-MS/MS und LC-MSn" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Technische Universität Berlin, Institut für Lebensmittelchemie durchgeführt. Im vorliegenden Projekt sollen auf der Grundlage langjähriger Erfahrung in der Rückstandsanalyse von PSM in Lebensmitteln und Wasser mittels GC/ MS Multimethoden mittels LC-MS/MS entwickelt werden, die Wirkstoffe in einer Methode zusammenfassen, die unter ähnlichen Ionisationsbedingungen eine gute Nachweisempfindlichkeit ermöglichen. Dabei sollen die vorwiegend für Trink- und Grundwasser relevanten polaren Herbizide in einer Multimethodensammmlung und die thermolabilen Fungizide und Insektizide, die hauptsächlich für Lebensmittel relevant sind in einer zweiten Multimethodensammlung zusammengestellt werden. Die Arbeiten sollen mit einem LCQ durchgeführt werden, weil mit diesem Gerät weniger Erfahrungen vorliegen als mit LC-MS/MS-Geräten mit Triple Quad-Technologie. Nach Ausarbeitung der Multimethoden sollen die Leistungsfähigkeit beider LC-MS/ MS-Technologien verglichen werden.

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