Das Projekt "Regulative Mechanismen der Genexpression intrazellulärer NO-Synthase in bronchoepithelialen Zellen in vivo und in vitro nach Exposition Faser- und Partikelförmiger Stäube" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Bochum, Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil, Abteilung für Pneumologie, Allergologie und Schlafmedizin durchgeführt. Einleitung/Ziele: NO (Stickstoffmonoxid) ist ein zelluläres Produkt und in der humanen Lunge bei Entzündungsprozessen vermehrt nachweisbar (z.B. Asthma bronchiale, Bronchiektasen). Da die vermehrte Oxidantienfreisetzung als ein wesentlicher proinflammatorischer Mechanismus bei staubinduzierten Lungenerkrankungen (z.B. Asbestose) angesehen wird, sollte in diesem Projekt die Frage geklärt werden, ob prooxidativ wirkende Stäube (Krokydolithasbest, Quarz) in Bronchialzellen und/oder in Alveolarmakrophagen (AM) zu einer Steigerung der zellulären NO-Produktion führen.
Studiendesign/Methodik: Das Forschungsvorhaben gliederte sich in einen in vitro und in einen ex vivo Abschnitt. In vitro wurden an verschiedenen Zellinien (A549, BEAS 2B) untersucht, ob und unter welchen Bedingungen sie NO produzieren (Griess-Reagenz) und ob die NO-Produktion mit der Induktion der zellulären iNOS (inducible NO-synthase) korreliert. Da vorwiegend A549-Zellen zur NO-Produktion in der Lage sind, wurde auf die Expositionsversuche von BEAS 2B-Zellen verzichtet. Folgende Untersuchungen wurden durchgeführt:
a) Quantifizierung der NO-Produktion (Griess-Reagenz) und iNOS Expression (Northern Blot-Analysen) vor und nach Stimulation mit Zytokinen (Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-a ), Interleukin-1ß (IL-1ß), Interferon-gamma (IFN-g ), je 10 ng/ml), Krokydolith und Quarz (Negativkontrolle: Latexpartikel);
b) Quantifizierung der NO-Produktion und Evaluierung deren Stimulierbarkeit in AM (gewonnen an Patienten mit pulmonalem Rundherd, n =30);
c) Detektion der iNOS mRNA (in situ Hybridisierung) in Bronchialschleimhautbiopsien (Raucher-/Nichtraucher; staubexponierte/nichtstaubexponierte Patienten; n=19);
d) Quantifizierung der NO-Produktion von A549-Zellen unter Koinkubation des Kulturüberstandes stimulierter (Krokydolith) AM (Kontrollen: L-NAME, entsprechende Zytokinantikörper.
e) Quantifizierung von TNF-a und IL-1ß in AM-Überständen (ELISA).