Das Projekt "Entwicklung eines Real-Time-Reverse-Transcriptase-PCR-Verfahrens zum Nachweis von Clostridium-botulinum-(Typ A, B, E und F)-Neurotoxin-Produktion in Lebensmitteln als Alternative zum Mäuse-Bioassay" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Gießen, Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Professur für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde durchgeführt. Projektziel war es, eine Ersatzmethode des bislang als 'golden standard' geltenden Mäuse-Bioassays ('Mäusetest') zum Nachweis von Clostridium botulinum-Neurotoxinen (Bont) in Lebensmitteln durch ein Real Time Reverse Transkriptase - PCR - Verfahren (Real Time RT - PCR) zu entwickeln. Clostridium botulinum (C. botulinum) ist ein obligat anaerobes, sporenbildendes Stäbchenbakterium, das zur Familie der Clostridiaceae gehört. Der weit verbreitete Erreger ist in der Lage, sieben verschiedene Neurotoxintypen (Bont/A-G) zu produzieren. Botulinumtoxine gelten als stärkste natürlich vorkommende Gifte, die beim Menschen und bei Tieren den Botulismus verursachen. Bei Lebensmittelvergiftungen stehen hauptsächlich die Typen A, B und E, seltener F, im Vordergrund, während bei den Tieren überwiegend die Typen C und D klinisch Botulismus hervorrufen können. Der klassische Nahrungsmittel-Botulismus ist eine lebensbedrohliche Intoxikation des Menschen. Nach einer Inkubationszeit von wenigen Stunden bis mehreren Tagen treten schwerwiegende Krankheitssymptome auf, die den Tod nach sich ziehen können. Die Untersuchung einer verdächtigen Lebensmittelprobe bedarf gemäß der DIN-Norm 10102/§ 64 LFGB, L 06.00-26 einer Anzahl von mindestens 54 Versuchsmäusen. Deshalb wurde als Alternativmethode ein Real Time Reverse Transkriptase-PCR-Verfahren (Real Time RT -PCR) zum Nachweis von C. botulinum Typ A-, B-, E- und F-Neurotoxinproduktion in Lebensmitteln entwickelt. Ein solches molekularbasiertes Verfahren dürfte gleichzeitig als Basis für die innovative Entwicklung von weiteren Ergänzungs- und Ersatzmethoden dienen. Es ist gelungen, ein molekularbasiertes Verfahren (Real Time RT-PCR-Verfahren) zu entwickeln, mit dessen Hilfe ein eindeutiger, sowohl qualitativer als auch quantitativer Nachweis einer Genexpression aller Lebensmittel-assoziierten C. botulinum Toxintypen (Typ A, B, E und F), einschließlich deren Subtypen, möglich ist. Als Ausgangsbasis zur Etablierung der neuartigen Methode dienten 67, mittels biochemischer, serologischer und molekularbiologischer Feindifferenzierungs- und Typisierungsverfahren als C. botulinum charakterisierte Stämme (24 Typ A-, 31 Typ B-, sechs Typ E- und sechs Typ F-Stämme). Durch die Etablierung entsprechender Primer-Sondensysteme konnte über dem Nachweis der mRNA und deren Transkription in die cDNA eine Bont A-, B-, E- und F-Produktion nachgewiesen werden. Die absolute Quantifizierung basierte auf einer dekadischen Verdünnungsreihe von Bont A-, B-, E- und F-cDNA und wurde anhand einer Standardkurve berechnet. Die relative Quantifizierung der Bont A, B, E und F erfolgte durch den Einsatz eines als endogene Kontrolle fungierenden 'Housekeeping'-Gens, unter Einbeziehung der vergleichenden Ct-Methode. Auf dieser Weise konnte die tatsächliche Expression und somit die reale Menge an produziertem Neurotoxin ermittelt werden. Insgesamt kann eine Methodenkaskade vorgestellt werden, die als Alternative zum Mäuse-Bioassay dienen kann.
Das Projekt "Development of a DNA-based system for tracking DNA of consumed plants in elaterid larvae" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Innsbruck, Institut für Ökologie durchgeführt. Im beantragten Projekt werden die Nahrungsbeziehungen von Pflanzen und bodenlebenden Insekten untersucht. Dabei erfolgt - weltweit erstmalig - der Nachweis von Phytophagie mittels molekularen Methoden bei wirbellosen Tieren. Als Modellorganismen dienen die Larven der Schnellkäfer ('Drahtwürmer), welche weltweit als bedeutende Schadorganismen im Agrarland bekannt sind. Das Projekt beinhaltet dringend notwendige Voruntersuchungen der komplexen Interaktionen zwischen Boden-lebenden Herbivoren und dem pflanzlichen Nahrungsangebot im Agrarland dar. Es dient in der Folge als Basis für ein im Anschluss daran, geplantes Projekt, das im Sommer 2007 beim FWF zur Einreichung gelangen soll. Die Arbeiten umfassen die Entwicklung artspezifischer Primer für Weizen und Mais. Als Genom wird das bereits erfolgreich für Pflanzen verwendete trnL-intron dienen. Die entwickelten Marker werden auf ihre Spezifität gegen ein umfassendes Set an pflanzlichen und tierischen Organismen getestet. Die Überprüfung der Sensivität wird mittels Verdünnungsreihen durchgeführt. Verschieden Methoden zur Extraktion, für Pflanzen-DNA aus Wurzeln werden eingesetzt um die am besten geeignete und kostengünstigste zu evaluieren. In einem Fütterungsexperiment bekommen die Schnellkäferlarven alternativ Weizen oder Mais als Futter angeboten und werden im Anschluss daran nach 0, 4, 8, 16, 24, 32, 48, 60 and 72 bei - 28Grad CC eingefroren. Die Larven werden als Ganzes - inklusive jeglicher im Verdauungstrakt enthaltenen Pflanzen-DNA - extrahiert. Anhand der von uns entwickelten spezifischen Primer können wir bestimmen, wie lange die DNA von gefressenen Pflanzen in den Drahtwürmern nachweisbar ist. Ein vorrangiges Ziel unserer Untersuchungen ist es auch, dabei die PCR Bedingungen für den Nachweis konsumierter Pflanzen zu optimieren (z.B. Annealing-Temperatur, Cycler-Bedingungen ect.).