Das Projekt "Entwicklung eines innovativen Verfahrens zur kombinierten Selektion und in vivo Evolution von Esterasen mit dem Ziel der Veränderung ihrer Enantioselektivität am Beispiel der rekombinant in E. coli vorliegenden Esterase aus Pseudomonas fluorescens SIKW1 (PFE-I)" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Greifswald, Institut für Biochemie, Abteilung Biotechnologie und Enzymkatalyse durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens:
Ziel dieses Projekts ist die Veränderung der Substratspezifität von Esterasen gegenüber chiralen Ver-bindungen (Carbonsäuren, Alkohole) mit der Methode der in vivo Evolution. Hierzu stehen mehrere rekombinante Esterasen im Arbeitskreis zur Verfügung (BsubE = Bacillus subtilis Esterase, BsteE = Bacillus stearothermophilus Esterase, BS2 = Esterase aus Bacillus subtilis, SDE = Streptomyces diastatochromogenes Esterase (5, 6) und PLE = Pig Liver Esterase). Der Schwerpunkt soll jedoch auf einer Esterase aus Pseudomonas fluorescens SIKW1 (PFE-I), kloniert in E. coli, liegen.
Die gerichtete Evolution von Enzymen ist eine sehr aktuelle Methode, bei der zunächst Mutationen - meist durch eine error-prone PCR - in vitro eingeführt und die daraus resultierenden Mutantenbibliotheken anschließend mittels Hochdurchsatzscreening auf gewünschte Varianten durchmustert werden. Obwohl es eine ganze Reihe eindrucksvoller Beispiele für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode gibt, fehlt jedoch der in der Natur erfolgende evolutive Druck (survival of the fittest).
Zur Einführung eines solchen evolutiven Drucks bietet sich die Verwendung des Mutationsstamms oder die Zugabe von chemischen Mutagenen an. Um die Richtung der Mutationen zu beeinflussen, werden dabei speziell ausgewählte Substrate zu einer Kultivierung im Minimalmedium zugegeben. Zum Beispiel kann die Spaltung des einen Enantiomers eine Kohlenstoffquelle liefern, die des anderen ein Antibiotikum oder ein toxisches Produkt freisetzen (Prinzip: Zuckerbrot und Peitsche). Diese Strategie ist der Kern dieses Projekts.
Fazit
Ein in vivo Selektionssystem zum Auffinden hochselektiver Esterasevarianten gegenüber 3-Phenylbuttersäureestern konnte für eine Positiv- (selektive Esterase, pEST) und eine Negativkontrolle (unselektive Esterase, BS2) etabliert und validiert werden. Die Durchmusterung von durch Sättigungsmutagenese erstellten Mutantenbibliotheken ergab bislang keine selektiveren Enzymvarianten. Die Anwendung einer in vivo Mutagenese (z. B. durch UV-Licht oder chemischen Mutagenen) und die Kombination mit der Selektionsmethode konnte innerhalb der Projektlaufzeit leider nicht erreicht werden.
Das Projekt "Nachhaltige Synthese chiraler alpha-Hydroxyketone durch gekoppelte enzymatische und chemische Katalyse" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Technische Universität Dresden, Institut für Mikrobiologie, Professur für Molekulare Biotechnologie durchgeführt. Ziel des Vorhabens ist die rationale Entwicklung eines nachhaltigen Syntheseansatzes zur Herstellung enantiomerenreiner alpha-Hydroxyketone als attraktive Schlüsselverbindungen für Pharmaka und Feinchemikalien. Innovative Schlüsseltechnologie ist die dynamisch-kinetische Racematspaltung, die durch integrierte chemisch katalysierte Racemisierung der Ausgangsenantiomere eine quantitative, hoch enantioselektive Darstellung der Zielenantiomere ermöglicht. Dieser ressourcenschonende Zugangsweg substituiert bisherige materialintensive und sicherheitsaufwändige organisch-synthetische Zugangswege und erweitert signifikant das Spektrum möglicher Produkte mit hohem Marktpotenzial. Die Vorhabensziele werden durch Entwicklung adäquater Routen zur Bereitstellung der racemischen Vorstufen und die Identifizierung, Optimierung und Bereitstellung von Biokatalysatoren mit hoher Stabilität und breitem Produktspektrum erreicht. Die praktische Relevanz des Ansatzes wird anhand der Herstellung ausgewählter Zielverbindungen im wiederholten Eintopfverfahren demonstriert.