Das Projekt "Entwicklung eines humanen Cornea-Modells für die okulotoxische Sicherheitsprüfung - Charakterisierung der SV40-immortalisierten Endothel- und Keratocytenzelllinie (Dissertation)" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Freie Universität Berlin, Institut für Pharmazie, Arbeitsgruppe Pharmakologie und Toxikologie durchgeführt. Bis heute existiert keine validierte Alternativmethode, die im Rahmen der Risikobewertung von Chemikalien und Arzneistoffen sowie der toxikologischen Sicherheitsprüfung von Kosmetika den Augenirritations-Test nach Draize am lebenden Kaninchen vollständig ersetzen kann. Für Substanzen mit starkem Augenirritations-Potential kann die Toxizität anhand verschiedener, validierter in vitro Assays im Rahmen einer abgestuften, von der OECD empfohlenen Teststrategie mit hoher Genauigkeit erfasst werden (BCOP-Assay, ICE-Methode). Substanzen mit sehr mildem Augenirritations-Potential können zukünftig möglicherweise durch kommerziell erhältliche, dreidimensionale Cornea-Epithelmodelle identifiziert werden, die sich momentan in der Validierung befinden (EpiOcularTM Modell, SkinEthik HCETM Modell). Dagegen muss insbesondere die Lücke im Bereich der milden bis moderaten Augenirritation durch neue Alternativmethoden geschlossen werden. Die Überprädiktivität/ hohe Sensitivität der dreidimensionalen Epithelmodelle sowie die Forderung nach einem mechanistischen Ansatz, der die Tiefe der cornealen Verletzung durch toxische Substanzen berücksichtigt und damit ermöglicht, die gesamte Bandbreite an Schweregraden okulotoxischer Reaktionen abzudecken (Jester et al., 2001), erfordert die Einbeziehung weiterer cornealer Schichten, Stroma und Endothel, in ein organotypisches in vitro Modell der Cornea. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, ein solches, von Zorn-Kruppa et al. etabliertes Komplettmodell der Cornea aus drei humanen, SV40-immortalisierten Zelllinien hinsichtlich des Kulturmediums zu optimieren und diese Endothel (EC)-, Keratocyten (HCK)- und Epithel (HCE)-Zelllinie an ein gemeinsames, möglichst serumfreies Wachstumsmedium zu adaptieren. EC und HCK wurden zudem in Abhängigkeit von Art und Serumgehalt des Kulturmediums hinsichtlich der Frage, ob die organotypischen Merkmale der primären Zellen trotz der SV40-Immortalisierung erhalten geblieben sind, charakterisiert. Die EC-Zelllinie wurde auf ihre Fähigkeit zur interzellulären Kontaktinhibition untersucht, welche nach dem Erlangen der zellulären Konfluenz die Vorraussetzung zur Ausbildung und Aufrechterhaltung eines organotypischen Endothel-Monolayers darstellt (Joyce et al., 2002). Die Keratocytenzelllinie HCK wurde in Monolayer-Kultur und nach Einbettung in die collagenöse Matrix des Stroma-Äquivalents phänotypisch und funktionell sowie in Abhängigkeit von Serum und Wachstumsfaktoren charakterisiert. Insbesondere wurde die Transformation der HCK in fibrotische Phänotypen nach Stimulation mit TGF beta untersucht, welche in vivo an cornealen Wundheilungsreaktionen beteiligt sind (Fini und Stramer, 2005, Jester et al., 1999).
Das Projekt "Synthese und Abbau von JH in parasitierten Wirtsraupen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität für Bodenkultur Wien, Institut für Forstentomologie, Forstpathologie und Forstschutz durchgeführt. Die endoparasitische Schlupfwespe ist ein wichtiger biologischer Gegenspieler des Schwammspinners, dessen Raupen weltweit zu den bedeutendsten Schädlingen der Eichenwälder gehören. Unsere bisherigen Untersuchungen über hormonelle Wechselwirkungen zwischen der Schwammspinnerraupe (Lymantria dispar) als Wirt und den Schlupfwespenlarven (Glyptapanteles liparidis) zeigten, dass eine Parasitierung zu einer Erhöhung des für die Entwicklung der Insekten entscheidenden Juvenilhormongehalts wie auch zu einem Wechsel des dominierenden Juvenilhormon-Typs in der Wirtsraupe führt. Durch den hohen Juvenilhormontiter, der v.a. kurz vor dem Ausbohren der Parasitenlarven aus ihrem Wirt auftritt, wird die Wirtsraupe in ihrer Entwicklung arretiert, so dass bei ihr eine weitere, energetisch aufwändige Häutung verhindert bzw. ihre Verpuppung unterdrückt wird. Die Erhöhung des Juvenilhormonspiegels im Blut der Wirtsraupe kann zum Teil durch eine parasitäre Hemmung des Hormon abbauenden spezifischen Enzyms, der Juvenilhormonesterase, erklärt werden. Unklar ist, wieso es durch die Parasitierung zu einer drastischen Veränderung der Juvenilhormontypen im Wirt kommt. In dem beantragten Projekt soll die Rolle der Parasitoidenlarven und ihrer assoziierten Faktoren (Venomsekret, symbiontische Polydnaviren, Teratocyten) bei der Synthese und beim Abbau der unterschiedlichen Juvenilhormontypen in den Zielorganen des Wirtstieres geklärt werden. Anhand von Implantations- und Inkubationsversuchen mit Parasitenlarven soll der Nachweis erbracht werden, ob diese grundsätzlich in der Lage sind, eigenes Juvenilhormon in den Wirt abzugeben. Darüber hinaus soll ihr Einfluss auf die Aktivität der Juvenilhormon produzierenden Drüse (Corpora allata) des Wirtes untersucht werden. Völlig unbekannt ist, auf welchem Weg Juvenilhormon im Gewebe der Insekten abgebaut wird. Durch den Vergleich der Aktivität der verschiedenen Juvenilhormon spaltenden Hydrolasen in Integument, Fettkörper und Mitteldarm der Wirtsraupe kann einerseits ein Beitrag zur Klärung dieser Frage geleistet, andererseits der parasitäre Effekt auf den Degradationsmechanismus festgestellt werden. Mit dieser Studie könnten somit wesentliche Wissenslücken über die komplexen hormonellen Wechselwirkungen zwischen Insekt und Insektenparasitoid geschlossen und grundlegende Erkenntnisse über den Abbau des Juvenilhormons im Insektengewebe gewonnen werden.
Das Projekt "Einfluss der Parasitierung durch Glyptapanteles liparidis (Hym., Braconidae) auf den Juvenilhormon-Metabolismus ihrer Wirtsraupe, Lymantria dispar (Lep., Lymantriidae)" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität für Bodenkultur Wien, Institut für Forstentomologie, Forstpathologie und Forstschutz durchgeführt. Die Parasitierung der Raupen des Eichenschädlings Lymantria dispar (Schwammspinner) durch die endoparasitische Schlupfwespe Glyptapanteles liparidis bewirkt eine Entwicklungshemmung im letzten Wirtsraupenstadium und verhindert deren Verpuppung. Aus unseren früheren Arbeiten wissen wir, daß diese Entwicklungsstörung mit einem erhöhten Gehalt an Juvenilhormonen (JH) der Raupe in Zusammenhang steht. Der Anstieg des JH-Spiegels in der Hämolymphe parasitierter Larven wird zumindest teilweise durch eine reduzierte Aktivität der Juvenilhormonesterase (JHE), dem spezifisch JH-abbauenden Enzym, verursacht. Aufgrund der zentralen Rolle, die das Enzym JHE in der Regulation des JH-Haushaltes spielt, soll die Auswirkungen der Parasitierung auf die Expression und Aktivität dieses Enzyms untersucht werden. Während der Eiablage werden verschiedene Komponenten wie Venom, Calyxflüssigkeit mit Polydnaviren und Parasiteneier, aus deren Hüllepithel später Teratocyten hervorgehen, in den Wirtskörper abgegeben. Ein Ziel des Projektes ist es zu klären, welcher dieser Faktoren für die Verringerung der Aktivität von JHE verantwortlich ist. Darüberhinaus soll festgestellt werden, auf welcher Ebene, der transkriptionalen oder der translationalen/posttranslationalen Ebene, eine Hemmung der Proteinexpression und damit eine Reduktion der Enzymaktiviät stattfindet. Schließlich soll die Möglichkeit der Reduktion der Enzymkonzentration in parasitierten Raupen durch Aufnahme von JHE in Perikardialzellen des Wirtes oder in den von den Parasiteneiern abstammenden Teratozyten untersucht werden.