Tetanusimpfstoffe werden aus dem Neurotoxin des Bakteriums Clostridium tetani durch chemische Inaktivierung hergestellt. Nach den Vorgaben des Europäischen Arzneibuchs muss das bei der Inaktivierung entstandene Toxoid durch in vivo-Toxizitätstests auf die Abwesenheit von Tetanustoxin und die Irreversibilität des Toxoids geprüft werden. Dabei werden Proben von jeder hergestellten Tetanustoxoid-Charge in 15 (für Humanimpfstoffe) bzw. 10 Meerschweinchen (für Veterinärimpfstoffe) injiziert, und die Tiere werden 3 Wochen in Bezug auf Symptome von Tetanus-Toxizität beobachtet. Das Projektziel besteht in der Entwicklung eines in vitro-Testsystems zum Nachweis bzw. Ausschluss von aktivem Tetanus-Neurotoxin (TeNT), das diese Tierversuche ersetzen kann. Da Zellkultur-basierte Modelle zur Detektion von Tetanus-Toxizität keine ausreichende Sensitivität bieten, konzentriert sich unser Projekt auf den funktionellen Nachweis von TeNT mit biochemischen Methoden. TeNT-Moleküle bestehen aus zwei Untereinheiten: Die schwere Kette vermittelt die Bindung und Aufnahme des Toxins in Nervenzellen, während die leichte Kette eine Proteasedomäne enthält, die in den Zellen spezifisch das Protein Synaptobrevin spaltet. Diese Spaltung hemmt die Freisetzung inhibitorischer Neurotransmitter und stellt den entscheidenden Schritt im Wirkmechanismus des Toxins dar. Frühere Ergebnisse unserer Projektgruppe hatten gezeigt, dass Methoden, die entweder ausschließlich auf dem Nachweis der Proteaseaktivität oder der Bindungsfähigkeit des Toxins beruhen, für eine sichere Bestimmung von Tetanus-Toxizität ungeeignet sind. Deshalb haben wir ein kombiniertes Testsystem entwickelt, das durch die funktionelle Verknüpfung von zwei Methoden beide für die Toxizität relevanten Eigenschaften von TeNT berücksichtigt. Die Besonderheit dieses Testsystems besteht darin, dass Toxinmoleküle nur dann ein Signal erzeugen, wenn sie sowohl eine funktionsfähige Bindungsdomäne als auch eine aktive Proteasedomäne besitzen - und wenn sich zudem diese Domänen auf separaten, durch Reduktion trennbaren Untereinheiten befinden. Wir konnten bereits zeigen, dass das kombinierte Testsystem zwischen giftigem TeNT und ungiftigem Tetanustoxoid unterscheiden kann. Außerdem kann aktives TeNT, das zu Impfstoff-Toxoiden künstlich zugesetzt wurde, mit diesem Testsystem detektiert werden. Das bisher entwickelte Testsystem ist demnach für den funktionellen Nachweis von Tetanustoxin geeignet. Vor allem die Sensitivität der Methode muss jedoch weiter verbessert werden. Das Ziel der derzeitigen Arbeiten besteht deshalb in der Optimierung diverser experimenteller Parameter, um die Nachweisgrenze der Methode an diejenige des Tierversuchs anzunähern. Weiterhin soll getestet werden, ob die Methode für die Prüfung von Tetanustoxoiden aller relevanten Impfstoffhersteller anwendbar ist. Längerfristig streben wir eine Aufnahme des kombinierten Testsystems in das Europäische Arzneibuch als Ersatz für die oben genannten Tierversuche an.