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Found 29 results.

Teilprojekt B

Das Projekt "Teilprojekt B" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Charité - Universitätsmedizin Berlin, Berlin-Brandenburg Center für Regenerative Therapien (BCRT) durchgeführt. Die autosomal rezessive Osteopetrose (ARO) entsteht durch einen Defekt der Knochen-abbauenden Osteoklasten und verläuft meist tödlich, wenn sie nicht rechtzeitig durch hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) behandelt wird. Diese Behandlung birgt jedoch hohe Risiken, da sie auf Allotransplantaten basiert. Eine Lösung wäre der Einsatz von autologen HSCs, bei denen der Gendefekt durch somatische Gentherapie kompensiert oder korrigiert wurde. Um diesen Ansatz zu testen, haben wir eine induzierte pluripotente Stammzelllinie (iPSC) von einem ARO-Patienten etabliert und ein System entwickelt, um iPSCs effizient in mononukleäre Zellen und Osteoklasten zu differenzieren. Zwei Gentherapieansätze sollen hier evaluiert werden: 1. CRISPR/Cas9-vermittelte Integration eines therapeutischen Konstrukts in einen Safe Harbor Locus, 2. zufällige Integration eines Transposon-basierten therapeutischen Konstrukts. Beide Strategien werden in iPSC-basierten Osteoklasten in kurzfristigen 2DKulturen und langfristigen 3D-Kulturen (Bone-on-a-Chip-System) getestet. Zunächst werden iPSC-basierte Monozyten allein im 3D-Gerüst in Osteoklasten differenziert. Im Folgenden werden diese Monozyten schrittweise mit mesenchymalen Stromazellen (MSCs) und Osteoblasten kombiniert. In einem letzten Schritt werden gentechnisch veränderte, iPSC-abgeleitete HSCs und Vorläuferzellen in das System aufgenommen und in Langzeitkulturen untersucht. Unser schrittweiser Ansatz ermöglicht eine umfassende präklinische Prüfung der neuartigen Gentherapie-Strategien für ARO und ersetzt damit den Einsatz von Mausmodellen, die zudem nur bedingt mit der humanen Situation vergleichbar sind.

Teilprojekt A

Das Projekt "Teilprojekt A" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Göttingen, Universitätsmedizin, Institut für Humangenetik durchgeführt. Die autosomal rezessive Osteopetrose (ARO) entsteht durch einen Defekt der Knochen-abbauenden Osteoklasten und verläuft meist tödlich, wenn sie nicht rechtzeitig durch hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) behandelt wird. Diese Behandlung birgt jedoch hohe Risiken, da sie auf Allotransplantaten basiert. Eine Lösung wäre der Einsatz von autologen HSCs, bei denen der Gendefekt durch somatische Gentherapie kompensiert oder korrigiert wurde. Um diesen Ansatz zu testen, hat die AG Kornak (UMG) eine induzierte pluripotente Stammzelllinie (iPSC) von einem ARO-Patienten etabliert und ein System entwickelt, um iPSCs effizient in mononukleäre Zellen und Osteoklasten zu differenzieren. Zwei Gentherapieansätze sollen hier evaluiert werden: 1. CRISPR/Cas9-vermittelte Integration eines therapeutischen Konstrukts in einen Safe Harbor Locus, 2. zufällige Integration eines Transposon-basierten therapeutischen Konstrukts. Beide Strategien werden in iPSC-basierten Osteoklasten in kurzfristigen 2D-Kulturen und langfristigen 3D-Kulturen (Bone-on-a-Chip-System) getestet, welches von der AG Geißler (Charité) etabliert werden konnte. Zunächst werden iPSC-basierte Monozyten allein im 3D-Gerüst in Osteoklasten differenziert. Im Folgenden werden diese Monozyten schrittweise mit mesenchymalen Stromazellen (MSCs) und Osteoblasten kombiniert. In einem letzten Schritt werden gentechnisch veränderte, iPSC-abgeleitete HSCs und Vorläuferzellen in das System aufgenommen und in Langzeitkulturen untersucht. Unser schrittweiser Ansatz ermöglicht eine umfassende präklinische Prüfung der neuartigen Gentherapie-Strategien für ARO und ersetzt damit den Einsatz von Mausmodellen, die zudem nur bedingt mit der humanen Situation vergleichbar sind.

Teilvorhaben 8: Innovative RNA Interferenz (RNAi)-vermittelte Bekämpfung von H. fraxineus, dem Erreger des Eschentriebsterbens

Das Projekt "Teilvorhaben 8: Innovative RNA Interferenz (RNAi)-vermittelte Bekämpfung von H. fraxineus, dem Erreger des Eschentriebsterbens" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von RLP AgroScience GmbH durchgeführt. Doppelsträngige (ds)RNA-Moleküle lösen RNA-Silencing, sog. RNA-Interferenz (RNAi), aus. Dies ist ein konservierter Mechanismus, der eine entscheidende Rolle bei Wachstum, Entwicklung, Wirtsabwehr von Pathogene und Transposon-Inaktivierung in Pflanzen, Pilzen und Tieren spielt. Ein wichtiges Merkmal von RNAi ist die Verarbeitung von dsRNA zu kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) durch die Aktivität von DICER (Dcr) bzw. in Pflanzen DICER-LIKE Enzymen (DCL). Die siRNAs werden dann in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) integriert, um den Abbau von komplementärer Ziel-RNA zu steuern. DsRNAs, die extern in Pflanzenzellen eingeschleust werden, werden ebenfalls von DCLs abgebaut, was zur Anhäufung von siRNAs führt, die dann den Abbau homologer RNA (Taget-RNA) bewirken. Da dsRNAs in vitro hergestellt und angewendet werden können, lassen sie sich so entwerfen, dass sie auf eine bestimmte Sequenz abzielen. Somit wird dsRNA mit einer Sequenzhomologie zu einem essentiellen Gen eines Pathogens zur Zerstörung des jeweiligen Transkripts führen, was die Vermehrung und das Überleben des betreffenden Pathogens beeinträchtigt. Wir beabsichtigen daher, dsRNA-Moleküle zu designen, die über Sequenzhomologie lebensnotwendige Gene von H. fraxineus stilllegen, und damit die Infektion zum Stillstand bringen. Aus den Transkriptomdaten, die von uns selbst erzeugt, bzw. die von Konsortialpartnern bereitgestellt werden, können die Sequenzen lebensnotwendiger Gene von H. fraxineus identifiziert werden Diese dsRNA-Moleküle sollen mit der von uns entwickelten Stamminjektion in infizierte Eschensämlinge, die im Rahmen des Verbundes zur Verfügung gestellt werden, eingebracht und ihre Wirksamkeit überprüft werden. Wir konnten bereits zeigen, dass nach Stamminjektion die verwendeten RNA-Moleküle effizient aufgenommen und systemisch in den betreffenden Pflanzen transportiert werden, daher scheint diese Applikationsmethode für die Bekämpfung von H. fraxineus besonders geeignet.

ERA Net Plant Genomics - MuExpress: Isolierung von Schlüsselgenen der Kornentwicklung in Mais aus einer Kollektion von 300 Mutator Transposon Mutantenlinien

Das Projekt "ERA Net Plant Genomics - MuExpress: Isolierung von Schlüsselgenen der Kornentwicklung in Mais aus einer Kollektion von 300 Mutator Transposon Mutantenlinien" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Hamburg, Fachbereich Biologie, Biozentrum Klein Flottbek und Botanischer Garten durchgeführt. Im MuExpress Projekt sollen Schlüsselgene der Kornentwicklung im Mais aus einer Population von 300 'Transposon mutierten' Pflanzen isoliert werden. Mit einer neuartigen Strategie werden hierzu Sequenzen isoliert, die Mutator-Transposon Insertionen flankieren (FST). Solche Sequenzen können Teil des mutierten Gens sein, das für den Phänotyp verantwortlich ist. Die Anwesenheit von bis zu 100 Mu-Transposons in einer Linie macht die Identifizierung des mutierten Gens sehr schwierig. Daher wird nach Mutator flankierenden Sequenzen in der mRNA des mutierten Maiskorns gesucht. Dies hat den Vorteil, dass nur solche FSTs erhalten werden, die von im Maiskorn aktiven Genen stammen. Die mRNA jeder Mutantenlinie wird in cDNA umgeschrieben. FSTs werden dann über PCR-Methoden amplifiziert, kloniert und sequenziert. Die FSTs der mutierten Gene im Maiskorn werden als Datenbank zusammengefasst. Kandidatengene, die mit der Mutation in der Nachkommenschaft kosegregieren, werden anschließend auf ihre Funktion untersucht. Neben dem wissenschaftlichen Wert haben die Ergebnisse des Projekts einen hohen agronomischen und wirtschaftlichen Wert. Sie können unmittelbar in der Züchtung eingesetzt werden.

Activation tagging in aspen using an inducible two component Ac/Ds-enhancer element system

Das Projekt "Activation tagging in aspen using an inducible two component Ac/Ds-enhancer element system" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Johann Heinrich von Thünen-Institut, Bundesforschungsinstitut für Ländliche Räume, Wald und Fischerei, Institut für Forstgenetik durchgeführt. Based on the Ac/Ds two element transposition system from maize an activation tagging approach is suggested for the hybrid aspen (Populus tremula x tremuloides) line -Esch5-. The proposed approach is based on results obtained from our earlier work on the genetic transfer of the maize transposable element Ac and its functional analysis in hybrid and pure aspen lines. It was shown that the Ac element is active in aspen and reintegrates elsewhere in genomic regions in high frequency. However, a two element transposon tagging system where Ac and Ds are put together in crosses is not feasible in trees due to the in part long vegetative phases. To overcome this barrier, an inducible two element Ac/ATDs element system is suggested to induce activation tagged variants following two independent transformation steps. In combination with a 35S enhancer tetramer and outward facing two CaMV 35S promoter located near both ends of the ATDs element, expression of genes can be elevated which are located adjacent to the new integration site of the element. As selective marker for ATDs transposition, both knocking-out the expression of a phenotypic marker (rolC gene) and a negative selection marker gene (tms) are considered. Thus, the transposition can easily be screened in primary transgenic lines.

Development and risk assessment of transgenic environmentally-friendly insect pest control methods for fruit flies and mosquitoes

Das Projekt "Development and risk assessment of transgenic environmentally-friendly insect pest control methods for fruit flies and mosquitoes" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Gießen, Institut für Phytopathologie und Angewandte Zoologie, Abteilung Angewandte Entomologie durchgeführt. Various species of pest insects cause substantial damage to agriculture every year, or transmit deadly diseases to animals and humans. A successful strategy to control pest insect populations is based on the Sterile Insect Technique (SIT), which uses the release of mass-reared, radiation sterilized male insects to cause infertile matings and thus reduce the pest population level. However, irradiation is not applicable to every insect species. Thus, new strategies based on genetic modifications of pest insects have been developed or are currently under investigation.The goal of the proposed research is to improve the development and ecological safety of genetically engineered (GE) insects created for enhanced biological control programs, including the SIT and new strategies based on conditional lethality. A major concern for GE insect release programs is transgene stability, and maintenance of their consistent expression. Transgene loss or intra-genomic movement could result in loss of strain attributes, and may ultimately lead to interspecies movement resulting in ecological risks. To address potential transgene instability, a new transposon vector that allows post-integration immobilization will be tested in the Mediterranean, Mexican and Oriental fruit fly tephritid pest species. In addition, the system will be established in the mosquito species Aedes and Anopheles - carriers of dengue and malaria.Random genomic insertion is also problematic for GE strain development due to genomic position effects that suppress transgene expression, and insertional mutations that negatively affect host fitness and viability. Diminished transgene expression could result in the unintended survival of conditional lethal individuals, or the inability to identify them. To target transgene vectors to defined genomic insertion sites having minimal negative effects on gene expression and host fitness, a recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) strategy will be developed that. RMCE will also allow for stabilization of the target site, will be tested in tephritid and mosquito species, and will aid to the development of stabilized target-site strains for conditional lethal biocontrol. This will include a molecular and organismal evaluation of an RNAi-based lethality approach. Lethality based on an RNAi mechanism in the proposed insects would increase the species specificity and having multiple targets for lethality versus one target in existing systems. By seeking to improve transgene expressivity and stabilization of transposon-based vector systems, this proposal specifically addresses issues related to new GE insects by reducing their unintended spread after field release, and by limiting the possibilities for transgene introgression.

Teilprojekt: Sequenzspezifische Transgenintegration in stark exprimierende genomische Positionen beim Raps

Das Projekt "Teilprojekt: Sequenzspezifische Transgenintegration in stark exprimierende genomische Positionen beim Raps" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Technische Universität Braunschweig, Institut für Genetik durchgeführt. Ziel des Projektes ist es, eine starke und sichere Expression von Genen in transgenen Pflanzen zu ermöglichen. Das setzt voraus, dass der genomische Ort der Transgenintegration gut charakterisiert ist und dass durch die Transgenintegration und -expression genomische Effekte auf die Wirtspflanze minimiert werden. Dazu sollen in der Kulturpflanze Raps mittels Transposons gut charakterisierte transgene Loci erzeugt werden, die für die sequenzspezifische Integration von weiteren Genkonstrukten an diesen Loci vorbereitet sind. Ein Ds-Transposon, welches z. B. lox Sites trägt, Ds:lox, wird mittels Ac Transposase in das Rapsgenom transponiert. Die Stärke der Transgenexpression wird mit einem Reportergen auf Ds::lox untersucht. Ds::lox benachbarte Sequenzen werden auf neu induzierte Transkripte und veränderte Genexpression analysiert. Es sollen Linien etabliert werden, die nach sequenzspezifischer Transgenintegration eine hohe Transgenexpression erlauben und bei denen keine unerwünschten Effekte im Rapsgenom beobachtet werden. Verwerter können Züchtungsfirmen sein, die die transgenen Rapslinien mit dem Transposonlocus für die Transgenintegration verwenden wollen.

Risikobewertung fuer das Freisetzen genmanipulierter Mikroorganismen

Das Projekt "Risikobewertung fuer das Freisetzen genmanipulierter Mikroorganismen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Bayreuth, Bayreuther Zentrum für Molekulare Biowissenschaften, Lehrstuhl für Genetik durchgeführt. Objective: Microorganisms deliberately released into the environment after rigorous testing are unlikely to prove a direct threat (i.e. as pathogens), and prediction of such risks is almost impossible. However, the main risk is the prospect of creating potentially hazardous new organisms following the transfer of mobile genes to native bacteria. Many bacteria can exchange genetic material, including plasmids and transposons; therefore the persistence and spread of both the organisms and genes are both important and would be affected by a variety of selective pressures. The results to be expected by this study are relevant at the methodological level as well as for its long term objectives. Techniques for sampling bacteria in the soil and for screening for the spreading of the manipulated microorganisms in the field, should be standardized. A precise evaluation of the effect of the selection pressure effect in the field of different systems should be obtained. An overall assessment of potential risks involved in the release of the respective bacteria into the environment would come from the analysis of the persistence of the inoculant strains in the field and from the evaluation of the transfer of the introduced genes to other bacteria in the soil. General Information: Aim of the research to be conducted in this research project is, - in cooperation with two other European laboratories - to monitor the persistence of genetically manipulated bacteria introduced into agricultural soils and to screen for the spread of genes carried by these micro-organisms to other members of the soil flora. Screening for the spreading of the genes will be performed by selection for the antibiotic resistance markers and by specific hybridization of DNA from the field strains with labelled probes for the introduced genes. Achievements: To investigate survival of introduced strains and their genes and to develop and assess monitoring methods, genetically marked derivatives of 2 common soil bacteria were used: Rhizobium which fixes atmospheric nitrogen in the root nodules of legumes (and has a long history) of safe and effective use as an agricultural inoculant) was used in both field and laboratory experiments; Enterobacter agglomerans which fixes nitrogen in association with cereal roots was studied in the laboratory. Strains were marked with genes conferring antibiotic resistance, either by selecting naturally occurring chromosomal mutations, or by insertion of transposon Tn5 to conjugative plasmids. In addition, native Rhizobium populations were screened for circumstantial evidence that genetic exchange occurs (over a long period) in the environment. The Tn5 marker enabled extensive monitoring of the Rhizobium inoculant, which showed significant variation in survival in field soils of the collaborating countries. The host plant was not required for its establishment.

Genetik der Biosynthese von Oberflaechenkohlenhydraten bei Rhizobium meliloti und ihre Rolle in der symbiontischen N2-Fixierung

Das Projekt "Genetik der Biosynthese von Oberflaechenkohlenhydraten bei Rhizobium meliloti und ihre Rolle in der symbiontischen N2-Fixierung" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Bielefeld, Fakultät für Biologie durchgeführt. In Zusammenarbeit mit dem Plant Research Center, Agriculture Canada, in Ottawa soll die Rolle der Oberflaechenkohlenhydrate von Rhizobium meliloti bei der Knoellchensymbiose mit Luzerne geklaert werden. Es ist geplant, mittels Transposonmutagenese Exopolysaccharid- (Eps-) und Lipopolysaccharid- (Lps-) Mutanten zu isolieren. Die betroffenen Gene sollen molekulargenetisch charakterisiert werden. Fuer diese Mutanten ist vorgesehen, sowohl die mutativ veraenderten Eps- und Lps-Strukturen aufzuklaeren als auch ihr Verhalten bei der Ausbildung von Wurzelknoellchen zu studieren. Es wird erwartet, dass mittels dieser Untersuchungen Signalmolekuele identifiziert werden koennen, die die Pflanze zur Ausbildung von Wurzelknoellchen benoetigt.

Genmanipulation des anaeroben Zymomonas mobilis fuer die Fermentierung von Staerkeabfaellen

Das Projekt "Genmanipulation des anaeroben Zymomonas mobilis fuer die Fermentierung von Staerkeabfaellen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Forschungszentrum Jülich GmbH durchgeführt. Objective: Zymomonas bacteria could offer considerable potential for improved alcohol fermentation in comparison with yeasts. An efficient expression vector is, however, an absolute requisite to open the possibility of genetically engineered zymomonas. The bacteria could then be made able to use for example renewable carbon substrates abundant in agriculture wastes. General Information: An efficient expression vector shall be constructed for zymomonas mobilis. For this, the promotor of the pyruvate decarboxylase gene will be isolated, sequenced and built into a broad host range plasmid. Genes for the degradation of amylose (from aspergillus awamorii) or xylose (from klebsiella) shall be placed under control of this strong promoter and expression will be tested in suitable escherichia coli strains. Afterwards, these recombinant plasmids shall be introduced into zymomonas mobilis cells and their expression and stability will be assayed. The long range aim is to study the recombinant strains for continuous ethanol production from agricultural waste substrates as starch and hemicellulose (xylose). Achievements: Zymomonas mobilis is a Gram negative anaerobe producing ethanol 5 to 6 times faster than yeast. It can use only glucose, fructose and sucrose as carbon sources. Therefore, applications of Z mobilis at the industrial level require extention of its spectrum of usable carbohydrates. Genetic improvement was approached through formal genetics and genetic engineering. Chemical mutagenesis, transposon mutagenesis, gene transfer by aided conjugation, construction of recombinant expression vectors and transfer into Z mobilis genes responsible for xylose metabolism were established and can now be applied to increase the substrate range of Z mobilis. Recombinant plasmids were constructed by subcloning fragments of native Z mobilis plasmids in known vectors. These were transferred into Z mobilis by aided conjugation and were stably inherited, especially after the loss of native plasmids. Subcloned Z mobilis plasmid sequences were used to construct new expression vectors, which could be transferred into Z mobilis and induce expression of the xylose catabolism genes xylA and xylB. However, the engineered strains could not ferment xylose. Transformation of Z mobilis by plasmid deoxyribonucleic acid (DNA) occurred at low frequencies only when sequences of incoming plasmid were integrated into the host's genome. Transposon mutagenesis was accomplished by conjugal transfer of transposon bearing plasmids from Pseudomonas, as well as Escherichia coli donors to Z mobilis. All Z mobilis strains tested were able to ferment extracts of various fruits, such as apples, oranges, peaches, watermelons, etc.

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