Das Projekt "Development and risk assessment of transgenic environmentally-friendly insect pest control methods for fruit flies and mosquitoes" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Gießen, Institut für Phytopathologie und Angewandte Zoologie, Abteilung Angewandte Entomologie durchgeführt. Various species of pest insects cause substantial damage to agriculture every year, or transmit deadly diseases to animals and humans. A successful strategy to control pest insect populations is based on the Sterile Insect Technique (SIT), which uses the release of mass-reared, radiation sterilized male insects to cause infertile matings and thus reduce the pest population level. However, irradiation is not applicable to every insect species. Thus, new strategies based on genetic modifications of pest insects have been developed or are currently under investigation.The goal of the proposed research is to improve the development and ecological safety of genetically engineered (GE) insects created for enhanced biological control programs, including the SIT and new strategies based on conditional lethality. A major concern for GE insect release programs is transgene stability, and maintenance of their consistent expression. Transgene loss or intra-genomic movement could result in loss of strain attributes, and may ultimately lead to interspecies movement resulting in ecological risks. To address potential transgene instability, a new transposon vector that allows post-integration immobilization will be tested in the Mediterranean, Mexican and Oriental fruit fly tephritid pest species. In addition, the system will be established in the mosquito species Aedes and Anopheles - carriers of dengue and malaria.Random genomic insertion is also problematic for GE strain development due to genomic position effects that suppress transgene expression, and insertional mutations that negatively affect host fitness and viability. Diminished transgene expression could result in the unintended survival of conditional lethal individuals, or the inability to identify them. To target transgene vectors to defined genomic insertion sites having minimal negative effects on gene expression and host fitness, a recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) strategy will be developed that. RMCE will also allow for stabilization of the target site, will be tested in tephritid and mosquito species, and will aid to the development of stabilized target-site strains for conditional lethal biocontrol. This will include a molecular and organismal evaluation of an RNAi-based lethality approach. Lethality based on an RNAi mechanism in the proposed insects would increase the species specificity and having multiple targets for lethality versus one target in existing systems. By seeking to improve transgene expressivity and stabilization of transposon-based vector systems, this proposal specifically addresses issues related to new GE insects by reducing their unintended spread after field release, and by limiting the possibilities for transgene introgression.
Das Projekt "Überlebensstrategie und Pathogenität von Clostridioides difficile in Abwasser, Klärschlamm, Oberflächengewässer, Gülle, Futtermittel und Silage - Behandlungsmöglichkeiten zur Risikominimierung (SUPER safe)" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Hochschule Emden,Leer, Fachbereich Technik, Abteilung Naturwissenschaftliche Technik, Fachgebiet Mikrobiologie-Biotechnologie durchgeführt. Das strikt anaerobe, Endosporen-bildende Bakterium Clostridioides difficile ist der Verursacher von nosokomialen Durchfallerkrankungen bei Mensch und Tier. Eine C. difficile Infektion (CDI) erfolgt meist nach einer Antibiotikabehandlung welche die Darmflora schädigt und bei der Wiederbesiedlung das Auskeimen von C. difficile ermöglicht. Weltweit ist eine Zunahme der Inzidenz so wie ein schwerer Verlauf von CDI zu beobachten was die Gesundheitskosten in die Höhe treibt und verstärkte Maßnahmen zur Infektions-Prävention und Kontrolle der Ausbreitung erfordert. Die Behandlung einer CDI wird dadurch erschwert dass Endosporen resistent gegenüber einer Antibiotikabehandlung sind. Vegetative Zellen und Sporen des Darmbesiedlers C. difficile werden mit den Fäzes ausgeschieden und können so in die Umwelt gelangen. C. difficile wird in Fäkal-belasteten Matrices wie Abwasser, Klärschlamm, Gülle und in mit Fäkalien in Berührung gekommenem Viehfutter oder Silage nachgewiesen. Durch den rasanten Anstieg der Anaerobtechnologie in Biogasanlagen zur Schlamm- oder Güllebehandlung kann davon ausgegangen werden, dass C. difficile in solchen Milieus überlebt oder sich sogar vermehrt und mit den Gär-Rückständen als Dünger in der Umwelt verbreitet wird. Ziel des geplanten Forschungsvorhabens ist, solche fäkal-belasteten Proben zu identifizieren und daraus C. difficile zu quantifizieren und Isolate zu charakterisieren. Neben dem Nachweis der Gene der Virulenzfaktoren für das Enterotoxin A und Cytotoxin B und dem binären Toxin CDT werden die Isolate einer Ribotypisierung und einer Antibiotikaempfindlichkeitstestung zur MHK Bestimmung unterzogen. Zudem sollen auch Antibiotika-Resistenzgene sowie konjugative Transposons nachgewiesen werden. Zum quantitativen Nachweis von C. difficile und dem Antibiotikaresistenz-vermittelnden konjugativen Transposon Tn5397 soll eine qPCR etabliert werden die es ermöglicht, Zellzahlen und Pathogenität von C. difficile in Fäkal-belasteten Proben zu bestimmen. Bedingt durch den hohen Stellenwert der Anaerobtechnologie für die Abwasserreinigung und Güllebehandlung sollen im Labormaßstab Biogasreaktoren aufgebaut und unter 'Realbedingungen' betrieben werden, um das Überleben, eine Vermehrung oder die Reduktion/Elimination von C. difficile Zellen/Sporen sowie die Exkretion des konjugativen Transposons Tn5397 zu testen. Diese Versuche sollen auch in Laboranlagen zur Simulation der konventionellen Güllelagerung sowie nach Behandlung in einer Labor-Ozonierungs- und UV-Entkeimungsanlage durchgeführt werden. Letztere werden unter anderem als vierte Reinigungsstufe zur Abwasserbehandlung in der Praxis empfohlen. Nur in Kombination von Umweltmikrobiologie und Verfahrenstechnik können die gesetzten Ziele erreicht und neues Wissen generiert werden um Aussagen bezüglich der Überlebensfähigkeit, Pathogenität und Verbreitungspfaden von C. difficile zu treffen und um das Infektionsrisiko für Mensch und Tier besser abschätzen zu können.
Das Projekt "Teilvorhaben 8: Innovative RNA Interferenz (RNAi)-vermittelte Bekämpfung von H. fraxineus, dem Erreger des Eschentriebsterbens" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von RLP AgroScience GmbH durchgeführt. Doppelsträngige (ds)RNA-Moleküle lösen RNA-Silencing, sog. RNA-Interferenz (RNAi), aus. Dies ist ein konservierter Mechanismus, der eine entscheidende Rolle bei Wachstum, Entwicklung, Wirtsabwehr von Pathogene und Transposon-Inaktivierung in Pflanzen, Pilzen und Tieren spielt. Ein wichtiges Merkmal von RNAi ist die Verarbeitung von dsRNA zu kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) durch die Aktivität von DICER (Dcr) bzw. in Pflanzen DICER-LIKE Enzymen (DCL). Die siRNAs werden dann in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) integriert, um den Abbau von komplementärer Ziel-RNA zu steuern. DsRNAs, die extern in Pflanzenzellen eingeschleust werden, werden ebenfalls von DCLs abgebaut, was zur Anhäufung von siRNAs führt, die dann den Abbau homologer RNA (Taget-RNA) bewirken. Da dsRNAs in vitro hergestellt und angewendet werden können, lassen sie sich so entwerfen, dass sie auf eine bestimmte Sequenz abzielen. Somit wird dsRNA mit einer Sequenzhomologie zu einem essentiellen Gen eines Pathogens zur Zerstörung des jeweiligen Transkripts führen, was die Vermehrung und das Überleben des betreffenden Pathogens beeinträchtigt. Wir beabsichtigen daher, dsRNA-Moleküle zu designen, die über Sequenzhomologie lebensnotwendige Gene von H. fraxineus stilllegen, und damit die Infektion zum Stillstand bringen. Aus den Transkriptomdaten, die von uns selbst erzeugt, bzw. die von Konsortialpartnern bereitgestellt werden, können die Sequenzen lebensnotwendiger Gene von H. fraxineus identifiziert werden Diese dsRNA-Moleküle sollen mit der von uns entwickelten Stamminjektion in infizierte Eschensämlinge, die im Rahmen des Verbundes zur Verfügung gestellt werden, eingebracht und ihre Wirksamkeit überprüft werden. Wir konnten bereits zeigen, dass nach Stamminjektion die verwendeten RNA-Moleküle effizient aufgenommen und systemisch in den betreffenden Pflanzen transportiert werden, daher scheint diese Applikationsmethode für die Bekämpfung von H. fraxineus besonders geeignet.
Das Projekt "Teilprojekt B" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Charité - Universitätsmedizin Berlin, Berlin-Brandenburg Center für Regenerative Therapien (BCRT) durchgeführt. Die autosomal rezessive Osteopetrose (ARO) entsteht durch einen Defekt der Knochen-abbauenden Osteoklasten und verläuft meist tödlich, wenn sie nicht rechtzeitig durch hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) behandelt wird. Diese Behandlung birgt jedoch hohe Risiken, da sie auf Allotransplantaten basiert. Eine Lösung wäre der Einsatz von autologen HSCs, bei denen der Gendefekt durch somatische Gentherapie kompensiert oder korrigiert wurde. Um diesen Ansatz zu testen, haben wir eine induzierte pluripotente Stammzelllinie (iPSC) von einem ARO-Patienten etabliert und ein System entwickelt, um iPSCs effizient in mononukleäre Zellen und Osteoklasten zu differenzieren. Zwei Gentherapieansätze sollen hier evaluiert werden: 1. CRISPR/Cas9-vermittelte Integration eines therapeutischen Konstrukts in einen Safe Harbor Locus, 2. zufällige Integration eines Transposon-basierten therapeutischen Konstrukts. Beide Strategien werden in iPSC-basierten Osteoklasten in kurzfristigen 2DKulturen und langfristigen 3D-Kulturen (Bone-on-a-Chip-System) getestet. Zunächst werden iPSC-basierte Monozyten allein im 3D-Gerüst in Osteoklasten differenziert. Im Folgenden werden diese Monozyten schrittweise mit mesenchymalen Stromazellen (MSCs) und Osteoblasten kombiniert. In einem letzten Schritt werden gentechnisch veränderte, iPSC-abgeleitete HSCs und Vorläuferzellen in das System aufgenommen und in Langzeitkulturen untersucht. Unser schrittweiser Ansatz ermöglicht eine umfassende präklinische Prüfung der neuartigen Gentherapie-Strategien für ARO und ersetzt damit den Einsatz von Mausmodellen, die zudem nur bedingt mit der humanen Situation vergleichbar sind.
Das Projekt "Teilprojekt A" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Göttingen, Universitätsmedizin, Institut für Humangenetik durchgeführt. Die autosomal rezessive Osteopetrose (ARO) entsteht durch einen Defekt der Knochen-abbauenden Osteoklasten und verläuft meist tödlich, wenn sie nicht rechtzeitig durch hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) behandelt wird. Diese Behandlung birgt jedoch hohe Risiken, da sie auf Allotransplantaten basiert. Eine Lösung wäre der Einsatz von autologen HSCs, bei denen der Gendefekt durch somatische Gentherapie kompensiert oder korrigiert wurde. Um diesen Ansatz zu testen, hat die AG Kornak (UMG) eine induzierte pluripotente Stammzelllinie (iPSC) von einem ARO-Patienten etabliert und ein System entwickelt, um iPSCs effizient in mononukleäre Zellen und Osteoklasten zu differenzieren. Zwei Gentherapieansätze sollen hier evaluiert werden: 1. CRISPR/Cas9-vermittelte Integration eines therapeutischen Konstrukts in einen Safe Harbor Locus, 2. zufällige Integration eines Transposon-basierten therapeutischen Konstrukts. Beide Strategien werden in iPSC-basierten Osteoklasten in kurzfristigen 2D-Kulturen und langfristigen 3D-Kulturen (Bone-on-a-Chip-System) getestet, welches von der AG Geißler (Charité) etabliert werden konnte. Zunächst werden iPSC-basierte Monozyten allein im 3D-Gerüst in Osteoklasten differenziert. Im Folgenden werden diese Monozyten schrittweise mit mesenchymalen Stromazellen (MSCs) und Osteoblasten kombiniert. In einem letzten Schritt werden gentechnisch veränderte, iPSC-abgeleitete HSCs und Vorläuferzellen in das System aufgenommen und in Langzeitkulturen untersucht. Unser schrittweiser Ansatz ermöglicht eine umfassende präklinische Prüfung der neuartigen Gentherapie-Strategien für ARO und ersetzt damit den Einsatz von Mausmodellen, die zudem nur bedingt mit der humanen Situation vergleichbar sind.
Das Projekt "Teilprojekt B: Entwicklung von Retrotransposon-basierten molekularen Werkzeugen für die Züchtung, Sortenidentifizierung und Genbankerhaltung von Kartoffeln - Retrokartoffel" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Technische Universität Dresden, Bereich Mathematik und Naturwissenschaften, Institut für Botanik, Lehrstuhl Zell- und Molekularbiologie der Pflanzen durchgeführt. Das Ziel des Projekts ist die Entwicklung von molekularen Verfahren der Genomanalyse für den Einsatz in der mittelständigen Pflanzenzüchtung und in Genbanksammlungen am Beispiel der Kartoffel. Das Vorhabens umfasst die Entwicklung, Testung und Auswahl von molekularen Markern, die in der anwendungsbezogenen Genomdiagnostik in der Sortenzüchtung, für die Sortenidentifizierung sowie für die Evaluierung der Biodiversität von genetischen Ressourcen eingesetzt werden sollen. Die zu entwickelnden molekularen Marker basieren auf SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements), die eine hochamplifizierte Sequenzklasse pflanzlicher Genome darstellen. Dazu werden an der TU Dresden durch den Einsatz von molekularen Methoden SINEs aus dem Kartoffelgenom identifiziert. Die experimentelle Strategie für die Identifizierung von SINEs beinhaltet auch die Analyse von in öffentlichen Datenbanken verfügbaren DNA-Sequenzen der Kartoffel mit bioinformatorischen Ansätzen; die dafür notwendige Software soll entwickelt werden. An die Identifizierung und Klonierung von Kartoffel-SINEs schließt sich eine eingehende molekulare Charakterisierung (Sequenz, Divergenz, Subfamilienstruktur) sowie die physikalische Kartierung durch hochauflösende, multi-colour Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) an. Durch FISH werden abundante SINE-Familien ausgewählt, die in der Kartoffel eine genomweite Verbreitung haben. Es sollen mindestens sieben bis neun verschiedene SINE-Familien identifiziert werden, die sich für die Ableitung spezifischer Primer eignen. Diese Primer werden dann für die PCR-basierte Erzeugung robuster molekularer Marker genutzt, indem DNA-Sequenzen zwischen SINE-Kopien amplifiziert und durch Gelektrophorese separiert werden. Charakteristische Amplikons können weiterführend in sortenspezifische Marker umgewandelt werden und lassen sich direkt für die Sortenidentifizierung oder Evaluierung von Sammlungsmustern einsetzen.
Das Projekt "Activation tagging in aspen using an inducible two component Ac/Ds-enhancer element system" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Johann Heinrich von Thünen-Institut, Bundesforschungsinstitut für Ländliche Räume, Wald und Fischerei, Institut für Forstgenetik durchgeführt. Based on the Ac/Ds two element transposition system from maize an activation tagging approach is suggested for the hybrid aspen (Populus tremula x tremuloides) line -Esch5-. The proposed approach is based on results obtained from our earlier work on the genetic transfer of the maize transposable element Ac and its functional analysis in hybrid and pure aspen lines. It was shown that the Ac element is active in aspen and reintegrates elsewhere in genomic regions in high frequency. However, a two element transposon tagging system where Ac and Ds are put together in crosses is not feasible in trees due to the in part long vegetative phases. To overcome this barrier, an inducible two element Ac/ATDs element system is suggested to induce activation tagged variants following two independent transformation steps. In combination with a 35S enhancer tetramer and outward facing two CaMV 35S promoter located near both ends of the ATDs element, expression of genes can be elevated which are located adjacent to the new integration site of the element. As selective marker for ATDs transposition, both knocking-out the expression of a phenotypic marker (rolC gene) and a negative selection marker gene (tms) are considered. Thus, the transposition can easily be screened in primary transgenic lines.
Das Projekt "Teilprojekt A: Entwicklung von Retrotransposon-basierten molekularen Werkzeugen für Züchtung, Sortenidentifizierung und Genbankerhaltung von Kartoffeln - Retrokartoffel" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Norika Nordring Kartoffelzucht- und Vermehrungs-Gesellschaft durchgeführt. Ziel des Verbundprojektes ist es, molekulare Verfahren der universitären Grundlagenforschung in der züchterischen und Genbank-Praxis nutzbar zu machen. Die an der TUD entwickelten anwendungsrelevanten molekularen Werkzeuge und die Verfahren ihres Einsatzes sollen in der mittelständigen Pflanzenzüchtung (Kartoffel) und in Genbanksammlungen etabliert werden. Sie werden für die Genomdiagnostik in der Sortenzüchtung, für die Sortenidentifizierung sowie für die Evaluierung der Biodiversität von genetischen Ressourcen im praktischen Züchtungsbetrieb und bei der Genbankarbeit Bedeutung erlangen. An der TU Dresden erfolgt die Isolierung und Charakterisierung von SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements) aus der Kulturkartoffel, sowie die Entwicklung SINE-basierter diagnostischer ISAP-Marker. Die entwickelten ISAP-Protokolle sollen anschließend in den Laboren der NORIKA und der Genbank etabliert, und die dafür notwendigen technischen Vorraussetzungen geschaffen werden. Das, für die Untersuchungen zur Sortenidentifizierung, sowie der genetischen und züchterischen Ressourcen, ausgewählte Pflanzenmaterial, wird durch die NORIKA und die Genbank in vitro und in situ bereitgestellt und erhalten. Der Einsatz von neuen molekularen Markern zur Analyse der genetischen Ressourcen im Zuchtmaterial, sowie des Genoms von Kreuzungsnachkommen wird die Effizienz der Sortenzüchtung deutlich verbessern. Die Nutzung neuer, markerbasierter Methoden zur Prüfung der Sortenidentität und -reinheit wird zudem zur Verbesserung der Qualitätssicherung beitragen.
Das Projekt "Teilprojekt C: Entwicklung von Retrotransposon-basierten molekularen Werkzeugen für Züchtung, Sortenidentifizierung und Genbankerhaltung von Kartoffeln - Retrokartoffel" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung durchgeführt. Ziel des Verbundprojektes ist es, molekulare Verfahren der universitären Grundlagenforschung in der züchterischen und Genbank-Praxis zu etablieren und einzusetzen. Die an der TU Dresden entwickelten molekularen Werkzeuge sollen in der mittelständischen Kartoffelzüchtung (NORIKA GmbH) und in der Genbank (Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung) genutzt werden An der TU Dresden werden aus der Kulturkartoffel SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements) isoliert, molekular charakterisiert und zu einem innovativen molekularen Markersystem (ISAP) entwickelt. Im Projekt werden ISAP-Marker im praktischen Züchtungsbetrieb im Rahmen der Genomdiagnostik (Sortenzüchtung, Sortenidentifizierung und Sortenreinheit) wie auch bei der Optimierung von in vitro-Erhaltungstechniken eingeführt und angewendet. Die Umsetzung der Projektziele ist im Hinblick auf die zunehmenden Anforderungen an Qualitätsmanagement und Koexistenz in der Landwirtschaft von großer Bedeutung. Gleichzeitig wird das ISAP-Markersystem für die effiziente Genotypisierung von Akzessionen in der Genbank (Duplikatanalyse, unterschiedliche Erhaltungsstrategien) sowie für die Evaluierung der Biodiversität von genetischen Ressourcen in der Genbank genutzt. Das Potential der ISAP-Technologie für die Entwicklung von molekularen Markern, die mit agronomisch wichtigen Merkmalen (Resistenzen, Stresstoleranz) gekoppelt sind, gewährleistet die wissenschaftliche und wirtschaftliche Anschlussfähigkeit des Projekts.
Das Projekt "ERA Net Plant Genomics - MuExpress: Isolierung von Schlüsselgenen der Kornentwicklung in Mais aus einer Kollektion von 300 Mutator Transposon Mutantenlinien" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Hamburg, Fachbereich Biologie, Biozentrum Klein Flottbek und Botanischer Garten durchgeführt. Im MuExpress Projekt sollen Schlüsselgene der Kornentwicklung im Mais aus einer Population von 300 'Transposon mutierten' Pflanzen isoliert werden. Mit einer neuartigen Strategie werden hierzu Sequenzen isoliert, die Mutator-Transposon Insertionen flankieren (FST). Solche Sequenzen können Teil des mutierten Gens sein, das für den Phänotyp verantwortlich ist. Die Anwesenheit von bis zu 100 Mu-Transposons in einer Linie macht die Identifizierung des mutierten Gens sehr schwierig. Daher wird nach Mutator flankierenden Sequenzen in der mRNA des mutierten Maiskorns gesucht. Dies hat den Vorteil, dass nur solche FSTs erhalten werden, die von im Maiskorn aktiven Genen stammen. Die mRNA jeder Mutantenlinie wird in cDNA umgeschrieben. FSTs werden dann über PCR-Methoden amplifiziert, kloniert und sequenziert. Die FSTs der mutierten Gene im Maiskorn werden als Datenbank zusammengefasst. Kandidatengene, die mit der Mutation in der Nachkommenschaft kosegregieren, werden anschließend auf ihre Funktion untersucht. Neben dem wissenschaftlichen Wert haben die Ergebnisse des Projekts einen hohen agronomischen und wirtschaftlichen Wert. Sie können unmittelbar in der Züchtung eingesetzt werden.
