Das Projekt "Entwicklung eines innovativen Verfahrens zur kombinierten Selektion und in vivo Evolution von Esterasen mit dem Ziel der Veränderung ihrer Enantioselektivität am Beispiel der rekombinant in E. coli vorliegenden Esterase aus Pseudomonas fluorescens SIKW1 (PFE-I)" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Greifswald, Institut für Biochemie, Abteilung Biotechnologie und Enzymkatalyse durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Ziel dieses Projekts ist die Veränderung der Substratspezifität von Esterasen gegenüber chiralen Ver-bindungen (Carbonsäuren, Alkohole) mit der Methode der in vivo Evolution. Hierzu stehen mehrere rekombinante Esterasen im Arbeitskreis zur Verfügung (BsubE = Bacillus subtilis Esterase, BsteE = Bacillus stearothermophilus Esterase, BS2 = Esterase aus Bacillus subtilis, SDE = Streptomyces diastatochromogenes Esterase (5, 6) und PLE = Pig Liver Esterase). Der Schwerpunkt soll jedoch auf einer Esterase aus Pseudomonas fluorescens SIKW1 (PFE-I), kloniert in E. coli, liegen. Die gerichtete Evolution von Enzymen ist eine sehr aktuelle Methode, bei der zunächst Mutationen - meist durch eine error-prone PCR - in vitro eingeführt und die daraus resultierenden Mutantenbibliotheken anschließend mittels Hochdurchsatzscreening auf gewünschte Varianten durchmustert werden. Obwohl es eine ganze Reihe eindrucksvoller Beispiele für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode gibt, fehlt jedoch der in der Natur erfolgende evolutive Druck (survival of the fittest). Zur Einführung eines solchen evolutiven Drucks bietet sich die Verwendung des Mutationsstamms oder die Zugabe von chemischen Mutagenen an. Um die Richtung der Mutationen zu beeinflussen, werden dabei speziell ausgewählte Substrate zu einer Kultivierung im Minimalmedium zugegeben. Zum Beispiel kann die Spaltung des einen Enantiomers eine Kohlenstoffquelle liefern, die des anderen ein Antibiotikum oder ein toxisches Produkt freisetzen (Prinzip: Zuckerbrot und Peitsche). Diese Strategie ist der Kern dieses Projekts. Fazit Ein in vivo Selektionssystem zum Auffinden hochselektiver Esterasevarianten gegenüber 3-Phenylbuttersäureestern konnte für eine Positiv- (selektive Esterase, pEST) und eine Negativkontrolle (unselektive Esterase, BS2) etabliert und validiert werden. Die Durchmusterung von durch Sättigungsmutagenese erstellten Mutantenbibliotheken ergab bislang keine selektiveren Enzymvarianten. Die Anwendung einer in vivo Mutagenese (z. B. durch UV-Licht oder chemischen Mutagenen) und die Kombination mit der Selektionsmethode konnte innerhalb der Projektlaufzeit leider nicht erreicht werden.
Das Projekt "ChemBioTec: Mikrodosiertechnik zur parallelen Optimierung der umweltfreundlichen biotechnischen Herstellung von Bernsteinsäure" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Technische Universität München, School of Engineering and Design, Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik durchgeführt. Jährlich werden 15 000 Tonnen Bernsteinsäure hauptsächlich durch chemische Prozesse aus fossilen Rohstoffen hergestellt und als Ausgangsstoff für Polyesterharze, Farbstoffe und Pharmazeutika verwendet (Zeikus et al. 1999). Die petrochemische Synthese von Bernsteinsäure, die Schwermetallkatalysatoren, hohe Temperaturen und hohe Drücke erfordert, erfolgt über die katalytische Hydrierung von Maleinsäureanhydrid oder Maleinsäure (Cornils und Lappe 2002). Auf Grund von ökologischen und ökonomischen Vorteilen besteht allerdings ein großes Interesse, diese Basischemikalie aus erneuerbaren Rohstoffen zu erzeugen. Hierfür bieten sich mikrobielle Produktionsverfahren an (McKinlay et al. 2007). In jüngster Zeit wurden zahlreiche Studien zur Bernsteinsäureproduktion mit prokaryotischen Wildtyp- oder rekombinanten Mikroorganismen publiziert (Zeikus et al. 1999, Wendisch et al. 2006, McKinlay et al. 2007). Berichte zum Einsatz eukaryotischer Mikroorganismen zur Bernsteinsäureherstellung sind dagegen selten. Im Rahmen dieses Vorhabens wurde die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ausgewählt, um das Potential für die Herstellung von Bernsteinsäure auszuloten. Dieser gut charakterisierte eukaryontische Mikroorganismus, dessen Genom vollständig sequenziert ist und der als eukaryontischer Modellorganismus dient, ist ein industriell etablierter, robuster Produktionsorganismus in der Weißen Biotechnologie. Saccharomyces cerevisiae wird beispielsweise seit vielen Jahrzehnten zur Herstellung von Bioethanol industriell eingesetzt. Prozesstechnisch vorteilhaft sind die hohe pH- und Osmotoleranz, die guten Wachstumseigenschaften, das breite Substratspektrum und die relative Unempfindlichkeit gegenüber organischen Säuren (Nevoigt, 1997). Außerdem sind sämtliche Werkzeuge zur genetischen Optimierung etabliert. Daher ist Saccharomyces cerevisiae ein attraktiver Kandidat zur Entwicklung neuer biotechnologischer Prozesse zur Herstellung von Basischemikalien wie Succinat (Hansen und Kielland-Brandt, 1996 Ostergaard et al., 2000). Zielsetzung dieses Forschungs- und Entwicklungsvorhabens war die Entwicklung eines Bernsteinsäureproduktionsstammes basierend auf Saccharomyces cerevisiae über gezieltes metabolisches Design des Zentralstoffwechsels. Um die Vielzahl der rekombinanten Hefestämme, die im Rahmen der iterativen Stammentwicklung hergestellt werden unter prozesstechnischen Bedingungen zu evaluieren und zu charakterisieren, wurde ein System aus parallelen Rührkesselreaktoren im Milliliter-Maßstab, bezeichnet als 'Bioreaktorblock', eingesetzt (Weuster-Botz et al. 2005). Um Ausbeuteverluste durch den Crabtree-Effekt der Hefe bei der Produktion von Bernsteinsäure zu vermeiden und einen effizienten Prozess zu etablieren, muss die Bernsteinsäureproduktion im Zulaufverfahren erfolgen.usw
Das Projekt "Teilprojekt 3: Untersuchungen zur Expression des Transgens unter Freilandbedingungen und zum Einfluss von Trockenstress auf die relative Fitness der transgenen Kartoffeln" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie durchgeführt. Im Vorhaben werden innerhalb des Verbundprojektes die Aufgaben Pflanzgutproduktion, Expressionscharakterisierung und Methodenpruefung zur Abschaetzung nicht-voraussagbarer Effekte wahrgenommen. 1. Fuer die Labor- und Freisetzungsexperimente des Verbundprojektes werden von den transgenen, fruktanbildenden Kartoffeln und der unveraenderten Ausgangssorte ('Wildtyp') Desiree Pflanzen vermehrt und Pflanzknollen unter Gewaechshausbedingungen produziert. 2. In Begleitung der Freisetzungsversuche wird die Expression des Transgens durch Messung der Gehalte von Fruktanen und Kohlenhydraten in verschiedenen Pflanzenorganen charakterisiert. 3. Zur Pruefung der Eignung der RNA-Expressionsprofilierungsmethode fuer die Risikoabschaetzung werden der Einfluss des Transgens, des Umweltfaktors Trockenheit und deren Wechselwirkung bezueglich der Regulation von RNA-Expression untersucht. Die Untersuchung soll den folgenden Thesen nachgehen: a) Die Expression von Genen der Fruktansynthese beeinflusst den Stoffwechsel, indem sie die Reaktion der Pflanze auf Trockenheit veraendert. b) Durch eine Wirkung loeslicher Stoffwechselprodukte als Signalstoffe werden Prozesse ausserhalb des Kohlenhydratstoffwechsels mitbetroffen. Die Arbeiten sollen klaeren, ob mit Hilfe von RNA-Expressionsprofilen abgeschaetzt werden kann, inwiefern die Transgenexpression neben den vorausgesagten, erwuenschten Effekten auch Effekte haben kann, die primaer nicht voraussagbar, aber fuer die Risikoabschaetzung relevant sind.
Das Projekt "Validierung und Einsatz verschiedener Biotests sowie Anwendung chemischer und mathematisch-statischer Methoden zur Bewertung der Belastung kleiner Fliessgewaesser - TV: Biotransformationsenzyme und TV: Chemometrische Methoden u. mathem. Modellbildung" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle, Sektion Chemische Ökotoxikologie durchgeführt. Ziel des Gesamtvorhabens ist es, durch eine vergleichende Analyse chemischer Expositionsprofile und der Expression einer breiten Palette von biologischen Reaktionen (Biotests) Kriterien fuer eine oekotoxikologische Bewertung der Belastung von Kleinfliessgewaessern zu entwickeln. Im Teilvorhaben 'Biotransformationsenzyme' werden Stellenwert und Aussagekraft der Induktion von Enzymen des Fremdstoffwechsels fuer eine oekotoxikologische Biotestbatterie untersucht. Im Teilvorhaben 'Chemometrische Methoden und mathematische Modellbildung' wird die Chemodynamik der Kontaminanten im Fliessgewaesser modelliert und im Hinblick auf Zusammenhaenge mit biologischen Antwortmustern analysiert.
Das Projekt "Umwelt- und ressourcenschonende biotechnologische Produktion verzweigtkettiger Aminosäuren als pharmazeutische Wirkstoffe durch Entwicklung von Hochleistungsproduktionsstämmen des Bakteriums Corynebacterium glutamicum und integrierte umweltentlastende Produktaufarbeitungsstrategie" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Amino GmbH durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Aminosäuren sind wirtschaftlich wertvolle Produkte. Dies gilt insbesondere für die eng verwandten verzweigtkettigen Aminosäuren L-Leucin, L-Isoleucin und L-Valin, deren Herstellung einer besonders großen Wertschöpfung unterliegt, und die unter anderem für pharmazeutische Zwecke in allerhöchster Reinheit benötigt werden. Es ist deswegen das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem ausschließlich eine der genannten Aminosäuren gebildet wird, ohne dass andere Aminosäuren oder weitere Nebenprodukte gebildet werden. Dadurch sind erheblich einfachere und somit umwelt- und ressourcenschonendere Aufarbeitungsverfahren nötig, um das reine Endprodukt zu erhalten. Fazit: Durch die Arbeiten ist es gelungen, einen umfassenden Einblick in die Funktion und Bedeutung einzelner Transaminasen für die Aminosäurebildung mit Corynebacterium glutamicum zu gewinnen. Es gelang die Substratspezifität der Transaminase AroT zu verändern und die Kristallstruktur der Transaminase HisC zu bestimmen. Ferner gelang es durch genetische Arbeiten zwei Transaminasen auszuschalten und dadurch einen L-Valin Produktionsstamm erheblich zu verbessern. Indem die L-Valinausbeute erhöht wird und zudem weniger von der Begleitaminosäure L-Alanin gebildet wird, ist ein erheblich einfacheres und somit umwelt- und ressourcenschonenderes Aufarbeitungsverfahren erforderlich, um das reine Endprodukt L-Valin in Infusionsqualität zu gewinnen.
Das Projekt "InnovationsCentrum Biokatalyse ICBio - Entwicklung einer aktivitätscharakterisierten Enzymbank für die Feinchemie auf Basis heterologer Expressionssysteme zur Beschleunigung der Realisierung nachhaltiger biokatalytischer Prozesse" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Greifswald, Institut für Chemie und Biochemie, Abteilung für Technische Chemie und Biotechnologie durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Enzymatische Prozesse, insbesondere stereoselektive Hydrolysen und Synthesen gewinnen in der modernen Feinchemie ständig an Bedeutung, da diese Verfahren zu einer erheblichen Ressourcenschonung und Umweltentlastung führen können. Trotz großer Fortschritte in der Molekularbiologie und Enzymologie und dem exponentiell wachsenden Verständnis von Struktur-Aktivitätsbeziehungen von Biokatalysatoren, stößt die breite Einführung derartiger Verfahren in die industrielle Anwendung aufgrund der Nichtverfügbarkeit von großen Sets an Enzymen und deren Bereitstellung in industriell erforderlichen Mengen und Qualitäten auf erhebliche Barrieren. Diesen Grundproblemen soll durch die Verfügbarmachung neuer und neuartiger Lipasen/Esterasen in industriekompatiblem Format begegnet und somit der Transfer biokatalytischer Prozesse in nachhaltige industrielle Anwendungen ermöglicht bzw. beschleunigt werden. Fazit: Im gesamten Projektverlauf wurden alle relevanten Methoden zur Erreichung eines wichtigen Ziels des Verbunds etabliert und erfolgreich angewendet: die rasche und zuverlässige Bereitstellung in Bezug auf Substratspektrum und Stereoselektivität charakterisierter Enzymbanken. Mit diesem Portfolio sollte eine Realisierung biokatalytischer Verfahren wesentlich vereinfacht sein, da sowohl die Identifizierung geeigneter Enzyme, die zudem rekombinant herstellbar sind, als auch Substratsynthesen und Informationen zur Aktivität und Stereoselektivität verfügbar sind. Für die Schweineleberesterase ist insbesondere bei einer Expression ohne Bildung von inclusion bodies mit einer schnellen Realisierung eines Produktionsverfahrens zu rechnen. Damit wäre die für die organische Synthese wichtigste Esterase in absehbarer Zeit in rekombinanter Form verfügbar.
Das Projekt "Untersuchungen zur Spezifitaet von pflanzlichen Regulationseinheiten (gewebespezifische und entwicklungsspezifische Genregulation)" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Rostock, Fachbereich Biowissenschaften, Institut für molekulare Physiologie und Biotechnologie durchgeführt. Das Umweltbundesamt (UBA) ist am Vollzug des Gentechnikgesetzes (GenTG), bei Freisetzung gentechnisch veraenderter Organismen (GVO) mit einem Einvernehmen, beim Inverkehrbringen mit einer Stellungnahme, beteiligt. In beiden Faellen ist eine Risikoabschaetzung fuer Mensch und Umwelt vorzunehmen. Bewertet wird u.a. auch die fuer die gentechnische Veraenderung verwendete DNA. Sie besteht i.d.R. aus drei funktionalen Teilen: Promotor, Strukturen und Terminator. Der Promotor ermoeglicht das Ablesen des Gens und ist gleichzeitig fuer die Gewebs- und/oder Entwicklungsspezifitaet zustaendig. - In dem Vorhaben sollen zunaechst die Promotoren zusammengetragen werden, die in gentechnisch veraenderten Pflanzen (GVP) Verwendung finden. Hierbei ist die diesbezuegliche Literatur bzw. sind die im UBA vorhandenen Antraege zu beruecksichtigen. Anschliessend ist zu pruefen, welche Spezifitaet (z.B. Gewebe-, Entwicklungsspezifitaet, Einfluss von Umweltbedingungen) die Promotoren besitzen und inwieweit diese ausgepraegt ist. Ebenfalls zu beruecksichtigen ist die Frage, ob die Promotoren in Prokaryonten (kernlose Organismen) aktiv werden koennen (Stichwort: horizontaler Gentransfer). Hierzu ist die einschlaegige Literatur heranzuziehen. - Bei der gentechnischen Veraenderung wird auch DNA prokaryontischen Ursprungs uebertragen. In diesem Zusammenhang interessieren insbesondere die prokaryontischen Promotoren. I.d.R. geht man davon aus, dass diese in eukaryontischen Organismen (kernhaltige Organismen), z.B. Pflanzen, nicht aktiv sind. Dieses ist zu ueberpruefen. Dazu soll zunaechst auch hier die diesbezuegliche Literatur gesichtet bzw. sollen die im Umweltbundesamt vorhandenen Freisetzungsantraege nach Gentechnikgesetz ueberprueft und die in Frage kommenden prokaryontischen Promotoren zusammengestellt und in bezug auf die o.g. Fragestellungen ausgewertet werden. Forschungsluecken sind in der Auswertung zu beruecksichtigen. Es sollen daher auch Vorschlaege gemacht werden, welche Promotoren in Zukunft experimentell untersucht werden muessen.
Das Projekt "ICBio - Biokatalytische Synthese chiraler Gamma-Diole und Gamma-Hydroxyketone" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Technische Universität Dresden, Institut für Biochemie durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens (S,S)-2,5-Hexandiol (HDO) ist ein essentielles chirales Synthon für chirale Übergangsmetallkatalysatoren sowie für die Wirkstoffsynthese. Gegenwärtige Synthesekonzepte leiden durchweg unter einer geringen Atomökonomie. Der derzeit leistungsfähigste, ganzzellbiokatalytische Zugang zur Zielverbindung soll optimiert werden. Dafür muss die partielle Hemmung der Bisreduktion von Acetonylaceton durch das intermediäre Hydroxyketon gelöst werden. Hierzu werden Methoden benötigt, die sowohl das Hydroxyketon als auch das Diol hochselektiv liefern. Es werden enzymatische und mikrobielle Ansätze getestet. Fazit Die angestrebte biokatalytische Synthese chiraler Diole und Hydroxyketone konnte erfolgreich realisiert werden. Die generelle Induzierbarkeit von Stressenzymen wurde belegt, gleichzeitig konnte das Anwendungspotenzial für diese Enzyme aufgezeigt werden. Mit ihrer Eigenschaft, Dione selektiv zum Hydroxyketon zu reduzieren, ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae ein unverzichtbare Biokatalysator für den kommerziellen Zugang zu dieser Substanzklasse, der als Ergebnis dieses Projekts neu eröffnet wurde. Mit der Kommerzialisierung der Verfahren wurde begonnen. Im laufenden Jahr sind bereits 20 kg verkauft und weitere 10 kg kundenseitig reserviert worden. Die Ergebnisse der Ökoeffizienzanalyse zeigen unzweifelhaft die ökologische und ökonomische Überlegenheit dieses Verfahrens. Die Meilensteine wurden fristgerecht erreicht.
Das Projekt "Förderschwerpunkt Biotechnologie: International Symposium: Enzymes in Lipid Modification 2003" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Greifswald, Institut für Biochemie, Abteilung Biotechnologie und Enzymkatalyse durchgeführt.
Das Projekt "Regulation und ökologische Aspekte zur Funktion der Serotypen von Paramecium" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Rheinland-Pfälzische Technische Universität Kaiserslautern-Landau, Fachbereich Biologie durchgeführt. Die äußere Zellmembran von Paramecium (Ciliata, Protozoa) wird von sogenannten Serotypproteinen bedeckt, die wie Mäntel ('surface coat') gewechselt werden, wenn sich die Umweltbedingungen im Lebensraum dieser einzelligen Tiere ändern. Genetisch identische Paramecien können nachweislich mehr als zehn unterscheidbare Serotypproteine synthetisieren, allerdings selten gleichzeitig, so dass ihr Serotypsystem ein attraktives Modell für Untersuchungen zur direkten Änderung von Genexpressionsmustern durch spezifische Umweltsignale ist. Die molekulare Untersuchung der von uns entdeckten Isogene des Serotyps 51D bietet sich für die Erforschung der Regulationsmechanismen besonders an, weil nicht experimierte Serotypgene vergleichend untersucht werden können und wir bereits mögliche regulatorische Regionen entdeckt haben. Die Arbeiten sollen fortgesetzt werden. Gleichzeitig eröffnen diese Vorkenntnisse und moderne Labortechniken (Immunfluoreszenzmikroskopie und PCR) jetzt die Möglichkeit für experimentell ökologische Experimente zur Serotypexpression im Ökosystem ' Tümpel bzw. Fließgewässer', die sich besonders auf verschiedenen ökologischen Aspekten zur potentiellen Funktion der Serotypen im Freiland konzentrieren sollen.
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