Das Projekt "Charakterisierung eines hypovirulenten Chrysovirus aus Fusarium graminearum: Prozessierung der viralen Proteine, Replikation und Infektion" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Hamburg, Fachbereich Biologie, Biozentrum Klein Flottbek und Botanischer Garten durchgeführt. Das Isolat Fusarium graminearum China 9 (Fg-ch9) zeigt nach Infektion auf Weizen und Mais gegenüber anderen Isolaten, wie dem Wildtyp Fg-PH1, eine verringerte Virulenz. Dieses Phänomen der Hypovirulenz ist von einigen filamentösen phytopathogenen Pilzen beschrieben worden und wird durch Mykoviren verschiedener Genera verursacht. Auch aus dem Fg-ch9 konnte ein isometrisches 35 bis 40 nm Mykovirus isoliert werden (V-ch9), dessen Sequenz eine hohe Ähnlichkeit mit Chrysoviren (Familie Chrysoviridae) aufweist. Das Genom dieses Mykovirus ist auf fünf dsRNAs verteilt, auf welchem jeweils ein Offenes Leseraster (ORF) für Proteine zwischen 79 und 127 kDa kodiert. Das 127 kDa Protein des ORF von RNA 1 kodiert für die RNA-abhängige RNA Polymerase, welche Bestandteil des Partikels ist. Die Translationsprodukte der ORFs von RNA 2 und RNA 3 bilden als prozessierte Derivate das Kapsid. Das Translationsprodukt von RNA 5 ist nicht Bestandteil des Partikels und weist Zink-Finger Motive auf. Für dieses Protein wurde die Fähigkeit zur Suppression von gene silencing nachgewiesen. Ob das Translationsprodukt von RNA 4 prozessiert wird und welche Funktion es hat, ist gegenwärtig unklar. Das Interesse an Mykoviren ist erst in den letzten Jahren gestiegen, so dass die Replikation und Interaktionen zwischen Pilz und Virus wenig erforscht sind. Nach der Sequenzierung und Klonierung der viralen RNAs des V-ch9 und ersten Analysen zur Funktion der von den ORFs exprimierten Proteine und deren Prozessierung sollen deswegen im nächsten Schritt die Prozessierung sowie das zeitliche Auftreten während der Replikation genauer untersucht werden. Aus diesen Daten können möglicherweise Rückschlüsse auf deren Funktion(en) gezogen werden. Die genaue Analyse der Funktion muss dann in einem weiteren Schritt mit Hilfe der Reversen Genetik analysiert werden. Da dsRNA Viren für ihre Replikation ihre RNA-abhängige RNA Polymerase und eine schützende Hülle benötigen, ist für das V-ch9 und alle anderen dsRNA Mykoviren die Reverse Genetik zwar prinzipiell möglich, jedoch ungleich aufwändiger als für ssRNA Viren, bei denen eine virale RNA infektiös ist. Neben dem System an sich fehlen für das Virus aus Fg-ch9 eine einfache Methode der Infektion und ein Wirt, in dem das Virus stabil repliziert. Hier sollen über die Testung der Infektion über Anastomosen und die Etablierung eines geeigneten Wirtes für die Replikation über Eliminierung des Virus aus Fg-ch9 bzw. Modifikation eines Laborstammes von F. graminearum weitere Voraussetzungen für das Etablieren eines Systems zur Reversen Genetik geschaffen werden.Bei Kenntnis der Replikation und Kenntnis der Funktion der viralen Proteine können Konzepte für den Einsatz der Hypovirulenz in der Praxis entwickelt werden.
Das Projekt "Veränderung der Xenobiotika-Sensitivität des Maispathogens Colletotrichum graminicola durch modifizierte Sterolbiosynthese" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Halle-Wittenberg, Institut für Agrar- und Ernährungswissenschaften, Professur Allgemeiner Pflanzenbau, Ökologischer Landbau durchgeführt. Pflanzenpathogene Pilze müssen sich in modernen Agrar-Ökosystemen und während der Infektion von Pflanzen mit verschiedenen antifungalen Substanzen (Fungiziden, Phytoalexinen, Phytoanticipinen) auseinandersetzen. Während die Xenobiotika-Resistenz zunehmend an Bedeutung gewinnt, sind ihre molekularen Grundlagen bei pflanzenpathogenen Pilzen bisher unzureichend verstanden. Am Maispathogen Colletotrichum graminicola konnten wir mit Hilfe von Suppression Subtractive Hybridization und cDNA-Array ESTs von 14 Genen isolieren, deren Expression nach Applikation subletaler Konzentrationen eines Strobilurin-Fungizides signifikant erhöht war. Das am stärksten Strobilurin-responsive Gen (CgERG6) kodiert für ein Enzym der Ergosterolbiosynthese, die ?-24-Sterol-C-Methyltransferase. Die Bedeutung dieses Gens für die Sterol-Zusammensetzung der Plasmamembran und die Resistenz gegenüber Xenobiotika soll in diesem Projekt untersucht werden. Um die allgemeine Gültigkeit der Hypothese zu prüfen, dass die Sterol-Zusammensetzung in verschiedenen Pilzen Xenobiotika-responsiv ist, sollen die ERG6-Transkriptkonzentrationen und die Sterol-Muster der Plasmamembranen von C. graminicola, Magnaporthe grisea, Fusarium graminearum, Ustilago maydis und Aspergillus nidulans nach Applikation von Fungiziden und pflanzlichen antifungalen Metaboliten untersucht werden. Durch Inaktivierung und Überexpression von CgERG6 soll geprüft werden, ob die Veränderung der CgERG6 Expressionsrate die Sterol-Zusammensetzung der Plasmamembran und die Sensitivität von C. graminicola gegenüber Xenobiotika steuert. Die veränderte Sterol-Zusammensetzung der Plasmamembran kann direkt zu einer reduzierten Permeabilität für Xenobiotika führen oder indirekt über die Veränderung der Aktivität der Efflux Transporter die intrazellulären Konzentrationen dieser Verbindungen beeinflussen. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen sollen in Kombination mit chemischen Inhibitoren von Efflux-Transportern eingesetzt werden, um den Zusammenhang zwischen Sterol-Zusammensetzung der Plasmamembran und aktivem Efflux Transport zu untersuchen.
Das Projekt "Erhöhung der Trichothecene-Resistenz von Pflanzen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität für Bodenkultur Wien, Department für Angewandte Pflanzenwissenschaften und Pflanzenbiotechnologie, Institut für Angewandte Genetik und Zellbiologie durchgeführt. Mykotoxine der Klasse der Trichothecene werden von verschiedenen Gruppen pflanzenpathogener Pilze gebildet. Es ist sehr wahrscheinlich, daß die Produktion von Trichothecenen die Virulenz dieser Pilze auf verschiedenen Wirtspflanzen erhöht. Trichothecene wirken als Inhibitoren der Proteinsynthese von Eukaryonten und sind deshalb sowohl für Pflanzen wie auch Tiere hochgiftig. Insbesonders der Befall von Weizen und Mais durch verschiedene Fusarium Arten kann zu einer unakzeptabel hohen Kontamination von Nahrungs- und Futtermittel führen. Trichothecene-resistente Mutanten der Hefe Saccharomyces cerevisiae werden untersucht um molekulare Mechanismen der Resistenz aufzuklären. Als ein Mechanismus wurden semidominant wirkende Mutationen am Wirkungsort, einem ribosomalen Protein charakterisiert. Die entsprechenden Änderungen werden in die evolutionär sehr stark konservierten Proteine von Pflanzen eingeführt und getestet, ob transgene Pflanzen erhöhte Trichothecene-Resistenz zeigen. Ein weiters Projektziel ist es zu klären, ob ähnliche Aminosäureänderungen am Wirkungsort auch der Mechanismus sind, der Trichothecene-produzierende Pilze vor ihrem eigenen Toxin schützt.