Bis heute existiert keine validierte Alternativmethode, die im Rahmen der Risikobewertung von Chemikalien und Arzneistoffen sowie der toxikologischen Sicherheitsprüfung von Kosmetika den Augenirritations-Test nach Draize am lebenden Kaninchen vollständig ersetzen kann. Für Substanzen mit starkem Augenirritations-Potential kann die Toxizität anhand verschiedener, validierter in vitro Assays im Rahmen einer abgestuften, von der OECD empfohlenen Teststrategie mit hoher Genauigkeit erfasst werden (BCOP-Assay, ICE-Methode). Substanzen mit sehr mildem Augenirritations-Potential können zukünftig möglicherweise durch kommerziell erhältliche, dreidimensionale Cornea-Epithelmodelle identifiziert werden, die sich momentan in der Validierung befinden (EpiOcularTM Modell, SkinEthik HCETM Modell). Dagegen muss insbesondere die Lücke im Bereich der milden bis moderaten Augenirritation durch neue Alternativmethoden geschlossen werden. Die Überprädiktivität/ hohe Sensitivität der dreidimensionalen Epithelmodelle sowie die Forderung nach einem mechanistischen Ansatz, der die Tiefe der cornealen Verletzung durch toxische Substanzen berücksichtigt und damit ermöglicht, die gesamte Bandbreite an Schweregraden okulotoxischer Reaktionen abzudecken (Jester et al., 2001), erfordert die Einbeziehung weiterer cornealer Schichten, Stroma und Endothel, in ein organotypisches in vitro Modell der Cornea. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, ein solches, von Zorn-Kruppa et al. etabliertes Komplettmodell der Cornea aus drei humanen, SV40-immortalisierten Zelllinien hinsichtlich des Kulturmediums zu optimieren und diese Endothel (EC)-, Keratocyten (HCK)- und Epithel (HCE)-Zelllinie an ein gemeinsames, möglichst serumfreies Wachstumsmedium zu adaptieren. EC und HCK wurden zudem in Abhängigkeit von Art und Serumgehalt des Kulturmediums hinsichtlich der Frage, ob die organotypischen Merkmale der primären Zellen trotz der SV40-Immortalisierung erhalten geblieben sind, charakterisiert. Die EC-Zelllinie wurde auf ihre Fähigkeit zur interzellulären Kontaktinhibition untersucht, welche nach dem Erlangen der zellulären Konfluenz die Vorraussetzung zur Ausbildung und Aufrechterhaltung eines organotypischen Endothel-Monolayers darstellt (Joyce et al., 2002). Die Keratocytenzelllinie HCK wurde in Monolayer-Kultur und nach Einbettung in die collagenöse Matrix des Stroma-Äquivalents phänotypisch und funktionell sowie in Abhängigkeit von Serum und Wachstumsfaktoren charakterisiert. Insbesondere wurde die Transformation der HCK in fibrotische Phänotypen nach Stimulation mit TGF beta untersucht, welche in vivo an cornealen Wundheilungsreaktionen beteiligt sind (Fini und Stramer, 2005, Jester et al., 1999).
Viele chemische Stoffe lassen sich experimentell an bestimmten Schleimhautgeweben daraufhin testen, inwiefern sie Zellprotrusionen proliferieren; Beispiele sind Lebensmittelzusatzstoffe und pharmazeutische Stoffe. Aussage: Gefaehrlichkeit von an sich ungiftig erscheinenden Stoffen und von als seltenermassen unvertraeglich erkannten Pharmaka.
Aufgrund der achten Novelle des Arzneimittelgesetzes (AMG) vom 7. September 1998 muss bei der Zulassung von Human- und Tierarzneimitteln die Umweltvertraeglichkeit geprueft werden. Die Kenntnis von Produktions- und Vermarktungsmengen eines Arzneimittelwirkstoffs ist fuer die Pruefung moeglicher Umweltauswirkungen unabdingbar. Auch sieht das Filterkonzept fuer Humanarzneimittel eine Umweltpruefung nur fuer mengenmaessig relevante Wirkstoffe vor . Entsprechende Daten darueber sind nicht verfuegbar und werden bislang auch in der Zulassung nicht erfasst. Im Rahmen des Vorhabens sollen Moeglichkeiten der Datenerhebung ermittelt und aufgezeigt werden und eine umfassende Zusammenstellung der auf dem Markt befindlichen Arzneimittelmengen erarbeitet werden. Hierbei ist zwischen Human- und Tierarzneimittel sowie der entsprechenden Anwendungsgebiete, Verschreibungspraktiken etc. zu differenzieren.
Im Rahmen der Zulassung von Tierarzneimitteln erfolgt gemaess Paragraph 28 AMG eine Pruefung der Umweltvertraeglichkeit des Arzneimittels und es koennen Auflagen zum Schutz der Umwelt erteilt werden. Die Bewertung der Umweltvertraeglichkeit erfolgt gemaess der europaeischen Leitlinie EMEA/CVMP 055/96, die zwar die zu pruefenden Eigenschaften und Wirkungen des Arzneimittels vorgibt, nicht jedoch sich daraus ableitende Kriterien fuer das Risikomanagement. Hinsichtlich des Risikomanagements liegen bislang nur wenig Erfahrungen vor. Daher soll im Rahmen des geplanten FuE-Vorhabens anhand von ausgewaehlten Fallbeispielen der Nutztierhaltung untersucht werden, wie Umweltrisiken von Arzneimitteln durch geeignete Auflagen im Zulassungsverfahren vermindert werden koennen. Fuer die Bearbeitung dieser Fragestellung ist zunaechst auf der Basis vorhandener Literatur eine Uebersicht ueber die bei den in Deutschland typischen Haltungsformen von Nutztieren (Rind, Schwein, Schaf, Gefluegel) uebliche Praxis der praeventiven und kurativen Anwendung von Arzneimitteln und pharmakologisch wirksamen Futtermittelzusatzstoffen zu erarbeiten. Hier kann z.T. auf bereits vom Umweltbundesamt durchgefuehrte Gutachten zurueckgegriffen werden, z.T. sind die vorhandenen Daten durch eine Literaturrecherche zu ergaenzen. Auf der Basis dieser Daten sollen Fallgruppen erarbeitet werden, die im Ueberblick auf die spezifischen Haltungsformen der verschiedenen Tierarten, die damit verbundenen Arzneimittelanwendungen und moeglichen Umweltrisiken repraesentativ erscheinen. Hierbei sind insbesondere Massentierhaltungen bzw. Behandlungen von grossen Tierbestaenden mit Arzneimitteln zu beruecksichtigen. Fuer diese Fallgruppen sollen landwirtschaftlich-veterinaermedizinische Grundlagen fuer Auflagen zum Schutz der Umwelt vor Auswirkungen durch die Anwendung von Arzneimitteln erarbeitet werden. Insbesondere sollen aus Sicht der landwirtschaftlichen Praxis Moeglichkeiten zur Verminderung des Eintrags von Arzneimitteln in die Umwelt (z.B. Alternativen bei der Lagerung und Ausbringung von Guelle, Massnahmen bei Tieren in Weidehaltung) sowie Alternativen in der Therapie oder in der Haltung von Nutztieren, die zu einer Verminderung des Umweltrisikos durch den Einsatz von Arzneimitteln fuehren; erarbeitet werden.
Risk-IT integriert Expertenwissen aus vorangegangen systemtoxikologischen Projekten mit innovativen in vitro Technologien (High Content Screening, Metabolomics) und reversem Physiologie-basiertem pharmakokinetischen (PBPK) Modelling, um den noch ungedeckten Bedarf an tierversuchsfreien Ansätzen zur Vorhersage systemischer Toxizität zu adressieren. Mit dem Fokus auf der Niere als ein wichtiges, exemplarisches Zielorgan für toxische Wirkungen von Fremdstoffen zielt Risk-IT darauf ab, einen Nachweis der Machbarkeit (Proof-of-Concept) für die erfolgreiche Integration neuer Mechanismus-basierter in vitro Methoden und toxikokinetischer Modellierung in eine mehrstufige, für regulatorische Entscheidungen geeignete Tests Strategie zu erbringen. Durch die Entwicklung neuer in vitro Assays mit hoher Prädiktivität für nephrotoxische Wirkungen von Chemikalien und Arzneistoffen nimmt Risk-IT unmittelbar Einfluss auf das 3R-Prinzip (replace, reduce, refine, auf Deutsch vermeiden, verringern, verbessern). Entsprechend dem 'Adverse Outcome Pathway' (AOP) Konzept der OECD werden basierend auf systemtoxikologischen Daten Schlüsselereignisse, die zu Nephrotoxizität führen, identifiziert und als Basis für die Entwicklung neuer, zellbasierter High-throughput Screening (HTS) Assays in humanen Nierenzellen herangezogen. Die entwickelten Assays werden gemeinsam mit einem offenen, LC-MS basierten in vitro Metabolomics Ansatz genutzt, um für einige gut-charakterisierte nephrotoxische Verbindungen Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen aufzustellen und jeweils die höchste Konzentration ohne Wirkung (no-observed-effect concentration, NOEC) abzuleiten. Durch quantitative in vitro-in vivo Extrapolation wird eine der NOEC entsprechende orale Dosis als Ausgangspunkt für die Risikobewertung ermittelt. Die basierend auf in vitro Daten erhobene Risikobewertung wird mit konventionellen Methoden verglichen, um einen Machbarkeitsnachweis zu erbringen und mögliche Stärken und Schwächen aufzuzeigen.