Das Projekt "Entwicklung eines innovativen biotechnologischen Verfahrens zur Herstellung bioabbaubarer Polymere durch erstmaligen Einsatz rekombinanter Hefen - Förderschwerpunkt: Biotechnologie" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle, Sektion Umweltmikrobiologie durchgeführt. Zielsetzung und Anlass des Vorhabens: Eine kommerzielle Nutzung mikrobiell erzeugter Produkte, wie Polyhydroxyalkanoaten (PHA), im Sinne einer Umweltvorsorge erscheint auf Grund ihrer Eigenschaften, insbesondere wegen ihrer biologischen Abbaubarkeit, und ihrer vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten sinnvoll und notwendig. Sie so preiswert zu produzieren, dass sie in der Konkurrenz mit eingeführten Kunststoffen wie Polypropylen oder Polyethylen bestehen, ist eine große Herausforderung an bio-, natur- und ingenieurwissenschaftliche Disziplinen. Weltweit werden Anstrengungen unternommen, dieses Ziel zu erreichen. Sie bestehen in der weiteren Optimierung vorliegender innovativer Verfahren sowie bekannter bakterieller 'Produzenten' und im Screening nach neuen Produzenten. Dabei stellt sich die Frage, wie gut es gelingt, Organismen, die sich bereits in anderen biotechnischen Prozessen bewährt haben und Vorzüge aufweisen, für die Synthese von PHA durch gentechnische Maßnahmen 'aufzubereiten'. Dazu zählt unter anderem die Backhefe Saccharomyces cerevisiae. Sie zur PHA(B)-Synthese zu befähigen, zu der sie als Wildtyp nicht in der Lage ist, wurde bereits erprobt. Dieser Projektvorschlag favorisiert zwei sog. nicht konventionelle Hefen: Arxula adeninivorans, die molekularbiologisch sehr gut untersucht ist und wofür ein Expressionssystem vorliegt, und die oleogene Hefe Debaryomyces hansenii, letztere, da sie bereits über eine metabolisch-regulatorische Prä-Disposition verfügen dürfte. Aufgabe war es, I) durch transformative Übertragung diese Spezies' zur PHB-Synthese zu befähigen, II) die Expression und Leistung(sfähigkeit) der Transformanten zu analysieren und iii) Methoden zum Aufschluss der Zellen und damit zur Gewinnung von PHA zu erproben. Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden: I): Die einzelnen PHB-Gene von R. eutropha (beta-Ketothiolase, Acetoacetyl-CoA-Reduktase, PHB-Synthase) bzw. das PHB-Synthasegen von M. extorquens wurden sowohl in die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Hefe-Modellsystem als auch in Arxula adeninivorans (als einem Modellobjekt für die heterologe Expression in einem 'Nicht-Saccharomyces-Stamm') und in die Fetthefe Debaryomyces hansenii übertragen und dort exprimiert. Durch Nutzung verschiedener Arxula-Stämme ließ sich ein möglicher Einfluss der Zellmorphologie auf die Produktbildung untersuchen. Für die Expression in Debaryomyces hansenii musste zunächst ein Expressionssystem entwickelt werden. Neben dem Nachweis der Aktivitäten der PHB-Enzyme wurde PHB nachgewiesen. Die Untersuchungen zur Expression in D. hansenii wurden, wie bei A. adeninivorans beschrieben, durchgeführt. Und II): Die Rekombinanten Hefen A. adeninivorans D. hansenii wurden batch wise und kontinuierlich vermehrt und die Produktbildung versucht zu provozieren bzw. zu stimulieren. Die Experimente wurden in Schüttelkolben und in Bioreaktoren (Fermentoren) durchgeführt, nur wenige im 'zig-Liter'-Maßstab. ...