Eine Substitution fossiler durch biogene Rohstoffe für stoffliche Anwendungen ist ein maßgeblicher Schritt zur Reduktion der anthropogenen CO2 Emissionen. Dabei sollte Biomasse im Sinne der Bioökonomie möglichst ganzheitlich und effizient genutzt werden, um die Flächeneffizient und den Beitrag zur Eindämmung des Klimawandels zu maximieren. Die hochwertige Verwendung von bisher kaum genutzten landwirtschaftlichen Reststoffen ist eine vielversprechende Methode zur Effizienzsteigerung. Die stoffliche Nutzung von Agrarreststoffen ist allerdings problematisch. Biogene Stoffe haben stets eine schwankenden Produktqualität. Deshalb ist eine Vorbehandlung und Auftrennung der Reststoffe auf verwertbare Bestandteile notwendig und ein entscheidender Schritt für die Weiternutzung. Deutschland und Taiwan stellen zwei Technologieführer mit hohem Umweltbewusstsein in ihrer jeweiligen Klimazone dar. Deutschland befindet sich in der gemäßigten Klimazone, während Taiwan sich in der (sub-)tropischen Klimazone befindet. Besonders vielversprechende landwirtschaftliche Reststoffe, die sich für eine stofflich Nutzung eignen und daher untersucht werden sollen, sind in der gemäßigten Klimazone Getreidestroh und in der (sub-)tropischen Klimazone Kakao- und Bananenschalen, sowie Reisstroh. Zudem fallen Tomatenpflanzenreste in beiden Klimazonen an. Im angestrebten Projekt wird der landwirtschaftliche Reststoff zunächst in einem hydrothermalen Aufbereitungsverfahren aufgeschlossen, um die anaerob kaum abzubauenden Fasern von den sehr gutvergärbaren Bestandteilen zu trennen. Dies wird in Deutschland mittels Thermodruckhydrolyse realisiert und in Taiwan mittel Überkritischer Wassermethode. Anschließend folgt eine Auftrennung in einem Flüssig/Fest-Separator. Der faserreiche Feststoff soll als Torfersatzprodukt und als Substrat zur mikrobiellen Zelluloseproduktion genutzt werden. Torf findet insbesondere im Gartenbau Anwendung, da er diverse Vorteile besitzt. Allerdings bildet sich Torf in Mooren nur sehr langsam und zur Gewinnung müssen die CO2-bindende Moore entwässert werden. Im Projekt soll untersucht werden in wie weit die produzierten Fasern Torf ersetzen können. Ein zweiter zu untersuchender Ansatz im Projekt ist es die Feststofffraktion als Nährmedium für Bakterienkulturen zu verwenden, die gezielt mikrobielle Zellulose produzieren. Die Flüssigkeit soll mithilfe innovativer zweistufiger Biogasanlage energetisch genutzt werden soll. Die Nutzung der Organik zur Biogasproduktion soll die Prozessenergie der energieintensiven Aufbereitung bereitstellen. Der TS-Gehalt der flüssigen Fraktion ist sehr gering, was bei herkömmlichen volldurchmischten Reaktoren eine lange Verweilzeit und somit ein sehr großes Reaktorvolumen verursacht. Um diese Nachteile zu reduzieren, sollen im Projekt zweistufige Reaktorsysteme untersucht werden. Während in Taiwan beide Fermenter volldurchmischt betrieben werden, wird in Deutschland der Methanreaktor als Festbettfermenter ausgeführt.
In diesem Projekt schlagen wir eine experimentelle und theoretische Zusammenarbeit vor, um lebende Aktuatoren aus gleitenden, fädigen Cyanobakterien zu entwickeln. Diese phototrophen Organismen spielen sowohl aktuell als auch historisch eine wichtige Rolle im Kohlenstoffkreislauf der Erde, da sie beispielsweise den atmosphärischen Sauerstoff und große Teile unserer fossilen Brennstoffe erzeugten. Filamente bestehen aus vielen linear verketteten Zellen. Sie haben einen Durchmesser von nur wenigen Mikrometern, können aber bis zu einigen Millimetern lang werden. In Kontakt mit festen Oberflächen oder anderen Fäden gleiten sie entlang ihrer Kontur und reagieren auf Lichtgradienten durch Richtungsumkehr. Die zu Grunde liegenden Mechanismen sind noch nicht vollständig geklärt. In natürlichen Lebensräumen führt diese Bewegung zur Aggregation in dichte Kolonien, die sich je nach Umgebungsbedingungen zusammenziehen oder wieder zerstreuen können, was eine kollektive Akklimatisierung ermöglicht. Wir werden diese Eigenschaften nutzen, um anpassungsfähige lebende Aktuatoren zu entwickeln, d. h. ein Material, das durch Stimulation mit Licht seine Form verändern kann. Die Bakterien werden in eine Matrix eingebettet, typischerweise ein gel- oder faserbasiertes Material mit maßgeschneiderten Eigenschaften und Strukturen, die im Projekt entwickelt werden. Indem wir die Bakterien mit Hilfe von Lichtmustern steuern und ausrichten, wollen wir ein aktives Netzwerk im Gerüst aufbauen, das sich bei Stimulation zusammenziehen kann. Die Kräfte aus dem aktiven Netzwerk werden entweder durch Adhäsion oder mechanische Verzahnung zwischen aktiven und passiven Komponenten übertragen. Durch die Abstimmung der gegenseitigen Ausrichtung von aktiven und passiven Netzen und ihrer Anisotropie wollen wir eine Kontrolle der Deformation erreichen. Auf langen Zeitskalen wird das Material adaptiv sein, da langfristige einwirkende Lichtmuster eine topologische Neuordnung des aktiven Netzes bewirken, so dass zwischen verschiedenen Aktuationsmodi gewechselt werden kann. Die Entwicklung von Manipulationsstrategien, die in der Lage sind, mechanische Arbeit zu extrahieren, erfordert Kenntniss der raum-zeitlichen Organisation der Krafterzeugung einzelner Filamente und ihrer Ensembles, welche bisher nicht verfügbar ist und in diesem Projekt gewonnen werden soll. Im Gegensatz zu den meisten bisher untersuchten lebenden Aktuatoren basiert unser System auf langen, flexiblen und beweglichen polymeren Bestandteilen, die äußerst robust und von Natur aus durch Licht stimulierbar sind: Die Fasernatur der lebenden Bestandteile ermöglicht es, stark verflochtene Netzwerke zu schaffen, die in einem breiten Spektrum von Umgebungsbedingungen bestehen können. Ihre Beweglichkeit und Reaktionsfähigkeit ermöglicht es, das Netzwerk selbst zu aktivieren, ohne dass die lebenden Bestandteile aufwendig modifiziert werden müssen.
Das Hauptziel dieses Vorschlags ist die Entwicklung biotechnologisch-modifizierte bakterieller Koazervate (EBCs) als neuartiges Hybridmaterial mit adaptiven Eigenschaften. In dieser Arbeit schlagen wir die Etablierung von EBCs als innovative Plattformen für die mikrobielle Biotechnologie vor, bei denen die Funktionalität von Bakterien durch ihre Interaktion mit Koazervaten verbessert wird. Einerseits fungieren die Koazervate als membranlose Käfige für die Lokalisierung von Bakterien in einem begrenzten Raum und ermöglichen eine kontrollierte Aufnahme und Freisetzung von Metaboliten. Andererseits werden die eingekapselten lebenden Bakterien den Protozellen einzigartige Eigenschaften verleihen, die sich durch gentechnische Eingriffe fein abstimmen lassen. Um dieses Ziel zu erreichen, ist der Forschungsvorschlag in drei Hauptziele unterteilt. Zunächst wollen wir eine Toolbox von EBCs mit verschiedenen Bakterien aufbauen. Insbesondere werden wir die Verkapselung biotechnologisch relevanter Bakterien in Koazervaten, die Lebensfähigkeit und die Stoffwechselaktivität der eingebetteten Bakterien sowie die Stabilisierung und Resistenz von EBCs über die Zeit und unter verschiedenen Bedingungen untersuchen. Zweitens wollen wir die Interaktion von EBCs mit ihrer Umgebung und ihr adaptives Verhalten untersuchen. Genauer gesagt werden metabolisch aktive EBCs auf die spezifische Induktion ausgewählter bakterieller Aktivitäten innerhalb der Koazervate getestet, was zu einer Manipulation der EBC-Funktionalität durch externe Stimuli führt. Außerdem soll die Interaktion zwischen verschiedenen stoffwechselaktiven EBCs untersucht werden. In diesem Zusammenhang werden wir untersuchen, ob Bakterien in einzelnen Koazervaten Metaboliten oder Signalmoleküle mit Bakterien in anderen Koazervaten austauschen können. Schließlich wollen wir die gegenseitige Interaktion von Bakterien und Koazervaten innerhalb der EBCs untersuchen. Insbesondere werden wir untersuchen, ob die künstliche Ansammlung von Bakterien in einem definierten Raum die gleichen Schutzeigenschaften gegen widrige Bedingungen bietet, wie es die Bildung eines Biofilms tun würde. Gleichzeitig werden wir die Rolle der Biofilmbildung in den Koazervaten und die Auswirkungen auf die Stabilität der Koazervate untersuchen. Insgesamt werden wir ein adaptives und selbstregulierendes Verhalten von EBCs erreichen, bei dem Koazervate und Bakterien ihre Eigenschaften auf der Grundlage externer Stimuli gegenseitig beeinflussen können. Wir wollen die Anwendbarkeit von EBCs in verschiedenen Prozessen wie der Fermentation oder der Behandlung von toxischen Abwässern testen.
Lebende technische Materialien (ELM) bieten aufgrund ihrer inhärenten Anpassungsfähigkeit und Multifunktionalität ein unvergleichliches Potenzial für die Entwicklung fortschrittlicher, nachhaltiger Materialien, insbesondere für biohybride lebende Antriebssysteme. Ein Nachteil solcher Systeme ist jedoch aktuell, dass sie nicht in der Lage dazu sind, ihre Form anzupassen und sich im Laufe der Zeit auszudehnen. Außerdem fehlen langfristig funktionale Zellsystemen. Wir planen in diesem Projekt räumlich und zeitlich anpassungsfähige Materialien zu erforschen, indem wir ein Biomaterial entwickeln, das aus Proteinmikrokapseln besteht und die biochemischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix nachahmt. Wir werden eine detaillierte Charakterisierung dieser Kapseln durchführen, einschließlich ihrer Biokompatibilität, mechanischer Tests und der Charakterisierung der Oberflächenstruktur. Die Dichte des entstehenden Kapselmaterials wird durch die Zwei-Photonen-Polymerisation gesteuert. Durch ihrer Adhäsions- und Mechanotransduktionsmechanismen können die Zellen diese adaptive Matrix autonom modifizieren und erweitern. Durch die Verwendung von Kapseln mit eingebetteten Wachstumsfaktoren, wie z. B. BMPs, wollen wir die myogene und osteogene Differenzierung mit räumlicher Präzision steuern und so langfristig funktionale Materialsysteme, z. B. als biohybride Roboter, etablieren.
Die Herausforderungen einer nachhaltigen Entwicklung erfordern Antworten auf komplexe Umweltprobleme wie Klimawandel, Verlust an Biodiversität, Verfügbarkeit von sauberem Wasser und biobasierten Materialien für die Kreislaufwirtschaft. Die jüngsten Fortschritte bei der Entwicklung analytischer Technologien bieten vielfältige Möglichkeiten, sich diesen Problemen erfolgreich zu stellen. Diese Entwicklungen gehen jedoch mit einer hohen Spezialisierung einher und bergen die Gefahr einer starken Fragmentierung der verschiedenen Disziplinen der Umweltwissenschaften. Gleichzeitig steigen die Kosten für den Betrieb der analytischen Instrumente kontinuierlich an. Die Etablierung eines Gerätezentrums (GZ) ‘Umweltanalytik’ an der TU Dresden (TUD) soll diese starke Fragmentierung überwinden und damit die Verfügbarkeit und die Zugänglichkeit zu modernen analytischen Instrumenten für Wissenschaftler der TUD und deren externer Partner verbessern. Das angestrebte GZ umfasst sehr innovative und äußerst komplexe Gerätesysteme für die (i) Analyse stabiler Isotope zur Prozessforschung, die Nutzung (ii) spektroskopischer Verfahren zur Identifizierung molekularer Strukturen organischer Substanzen und die Nutzung (iii) der Rasterelektronenmikroskopie (Environmental Scanning Electron Microscopy) zur Erforschung von Mikro- und Nanostrukturen. Diese Kerntechnologien werden ergänzt durch eine breite Palette an unterstützenden analytischen Verfahren, womit insgesamt ein großes Potential für eine integrative Forschung in den Umweltwissenschaften besteht. Die integrative Datenanalyse wird ein weiterer Bestandteil des angestrebten GZ sein. Es wird ein Managementsystem entwickelt, das einen einfachen Zugang und eine effiziente gemeinsame und kostengünstige Nutzung aller Instrumente ermöglicht. Dies ist Voraussetzung einer tiefgreifenden Integration der Umweltwissenschaften und wird gleichzeitig zu einem fruchtbaren Austausch von Wissenschaftlern unterschiedlicher Disziplinen führen. Der Aufbau des GZ wird zu neuen Qualitätsstandards in der Umweltanalytik beitragen. Das GZ geht weit über das Angebot der Nutzung analytischer Kapazitäten hinaus. Die Nutzer werden bei der Auswahl der am besten geeignetsten Kombination analytischer Verfahren wissenschaftlich fundiert beraten. Außerdem wird eine gemeinsame integrative Auswertung bei komplexen Umweltdaten angeboten. Durch das GZ werden besonders interessierten Studenten und jungen Forschern Qualifizierungskurse angeboten. Damit wird das GZ der interdisziplinären Spitzenforschung in den Umweltwissenschaften an der TUD einen starken Impuls verleihen. Externe Partner erhalten mehr Möglichkeiten zur erfolgreichen Zusammenarbeit mit ihren Partnern an der TUD. Dies wird zur Generierung neuer Forschungsideen und deren Umsetzung in wissenschaftlichen Projekten führen. Damit wird das Gerätezentrum zu wissenschaftlich exzellenten Lösungen der komplexen Umweltprobleme beitragen, mit denen unserer Gesellschaft konfrontiert ist.
Heutige biologische und einstellbare Leuchtmittel, die lebende Bausteine integrieren, sind im Wesentlichen auf Zellen beschränkt, die Biochemilumineszenz mit begrenzter Stabilität und Lichtausbeute nutzen (d. h. einige Tage bei Lichtausbeuten <5 lm/W). Tatsächlich gibt es keine Beispiele für lebende Leuchtmittel, die Photonenumwandlungssysteme zur Manipulation von Licht nutzen. Wir haben kürzlich eine neue Methode zur Herstellung lebender Farbfiltern mit Vibrio natriegens entwickelt. Dieses Bakterium weist (I) ein vielversprechendes Potenzial für die Biotechnologie mit einer außerordentlich hohen Wachstums- und Substratverbrauchsrate, (II) einen bereits sehr guten Ertrag bei der Expression hochwertiger fluoreszierender Proteine (FP) und (III) eine vielversprechende Kompatibilität mit Matrizen, die für Leuchtmittel von großem Interesse sind, auf. Tatsächlich haben vorläufige Experimente Leuchtmittel erzeugt die eine bessere Leistung aufweisen als diejenigen die mit denselben FP in Referenzmatrizen hergestellt wurden. Die aktuellen Hindernisse hängen mit dem Mangel an grundlegendem Wissen zusammen, um (I) die Expression beliebiger FP erfolgreich zu optimieren, (II) die Widerstandsfähigkeit und Kompatibilität in den Matrizen zu verbessern, (III) eine Anpassungsfähigkeit an externe Reize einzuführen und (IV) die besten Leuchtmittelarchitekturen und Betriebsarten zur Maximierung der Leuchtmittelleistung zu erstellen. Das ENABLED-Projekt wird all diese offenen Fragen bearbeiten und dabei die Disziplinen Metabolic Engineering, Synthetische Biologie, Materialwissenschaft und Biooptoelektronik miteinander verbinden. ENABLED wird insbesondere grundlegende Konstruktionsregeln für die Entwicklung von V. natriegens-Stämmen mit (I) optimierter flexibler Einzel- und Doppelemission, (II) verbesserter Widerstandsfähigkeit in Farbfiltern, um ihre Wiederverwertbarkeit nach der Verwendung in Leuchtmitteln zu ermöglichen, und (III) einer Anpassungsfähigkeit an die Temperatur in Farbfiltern, um die Zellregeneration nach der Verwendung in den Leuchtmitteln zu ermöglichen. Dies wird es uns ermöglichen, eine neue Familie von Regenbogen- und weißen Bakterien-Hybrid-Leuchtdioden einzuführen, die bislang nicht zur Verfügung stehen.
Ziel von ProbioGel ist, durch synergetische Kombination modifizierter Mikrogele und probiotischer Bakterien (PB) „Engineered Living Materials“ als antibiotikafreie Hauttherapeutika zu entwickeln. Wir erarbeiten grundlegende Designkonzepte und Regeln für die Herstellung eines “lebenden Gel-Hautpflaster-ELMs”, das Bacteriocin-produzierende, Hautpathogene-hemmende PB und funktionale Mikrogel-basierte, makroporöse 3D Scaffolds (MAPs) enthält, die sich wechselseitig beeinflussen. In diesem Projekt werden wir den Vliesstoff, der im etablierten ProbioPad zwischen zwei Membranen eingeschlossen wird, durch ein MAP ersetzen. Dadurch werden die Zell-Zell-Interaktion und die Verfügbarkeit von Nährstoffen durch Diffusion erhöht und somit die Proliferation der PB besser reguliert. Die nicht-lebenden MAP werden mit Haftstellen für die PB modifiziert und können so durch die lebenden PB vernetzt und gestaltet werden. Die MAP werden so modifiziert, dass sie die antimikrobielle Wirksamkeit der PB steuern können, z.B. durch Steigerung der Bacteriocin-Produktion über kontrollierte Freisetzung induktiver Moleküle. Design-Parameter für die mittels In-Mold-Polymerisation oder Mikrofluidik hergestellten stäbchenförmigen Mikrogele, wie Größe, Seitenverhältnis, Steifigkeit, Reaktivität, Biomodifizierung und Reaktionsfähigkeit gegenüber externen Signalen werden systematisch variiert. Untersucht wird, wie diese Parameter die dynamische Struktur der Mikrogele, Bakterienwachstum, Produktion, Diffusion und Freisetzung von Bacteriocinen, antimikrobielle Wirkung und das Upscaling des ProbioGel-ELM beeinflussen. Zusätzlich wird eine Strategie zur biologischen Sicherheit entwickelt, die das Überleben der PB auf die MAPs begrenzt. Zunächst werden die interaktiv und reaktionsfähig designten Mikrogele und die PB wie beim ProbioPad in ein Membran-Encasing zur Ausbildung des MAP-Scaffolds injiziert. Dies gewährleistet die antimikrobielle Wirksamkeit und intrinsische Sicherheit und ermöglicht die klinische Umsetzung. Danach wird die feste Membran durch einen weicheren, mechanisch flexiblen Hydrogelfilm ersetzt, dessen Zusammensetzung und Maschenweite das Entweichen der PB einschränkt. Die antimikrobielle Wirksamkeit des ProbioGels mit den darin enthaltenen Mikrogelen und PB wird mittels Antagonismus-Tests auf Agarplatten gegen definierte pathogene Mikroorganismen und schließlich mit einem ex vivo Hautinfektionsmodell bestimmt. Entscheidend ist die Booster-Freisetzung von therapeutischen Molekülen nach Hautkontakt und Hydratisierung der MAP über das Erkennen eines Signalmoleküls, das von stark infizierten Wunden stammt. Dies führt zu einer kaskadenartigen Anpassung der lebenden PB im nicht-lebenden MAP und zu einer schaltbaren, erhöhten Freisetzung der therapeutischen Moleküle aus dem ProbioGel_ELM. Die Mikrogele - funktionalisiert und für den 3D-Druck - können anderen Forschern im SPP zur Verfügung gestellt werden. Auch adaptive Linker und Biocontainment Strategien können geteilt werden.
Engineered Living Materials (ELMs) werden zunehmend als die am vielversprechendste Lösung für die praktische Anwendbarkeit der synthetischen Biologie angesehen und rücken damit verstärkt in den Fokus der Forschung. Bei diesen Materialsystemen ermöglicht die Verkapselung gentechnisch veränderter Organismen die Herstellung in anwendungsgerechten Formaten, eine einfache Handhabung, die stabile Lagerung sowie den Einsatz in großem Maßstab. Von besonderer Bedeutung ist die sichere Verkapselung beim Einsatz von Bakterien als lebende Komponente, da sich diese Organismen durch hohe Wachstumsraten, geringe Größe und beispiellose Anpassungsfähigkeit auszeichnen. Bisher gibt es nur wenige Studien, die sich konkret mit der Eindämmungsfähigkeit von ELMs befassen. Bei diesen kamen mehrschichtige Materialsysteme zum Einsatz, bei denen das Wachstum der Bakterien durch eine stabile Barrierehülle physikalisch auf das Materialinnere begrenzt wurde. Dieses Konzept ist jedoch äußerst anfällig für Versagen durch Beschädigung der Hülle oder durch Herstellungsfehler, die zur Freisetzung der Bakterien führen. Eine andere Eindämmungsmöglichkeit bieten genetische Methoden, wie Auxotrophie oder Tot-Schalter. Diese Strategie wiederum ist anfällig für Versagen durch Mutationsflucht. Da die jeweiligen Nachteile der beiden Strategien voneinander unabhängig sind, besteht die Erwartung, dass sich durch Kombination die jeweiligen Probleme überwinden lassen. ContainELMs wird diese Möglichkeit systematisch auf synergistische Weise untersuchen. Dabei werden die Bakterien genau an die spezielle Mikroumgebung angepasst, die das Materialinnere bietet. Dies wird durch die Entwicklung von Überlebens-Schaltern erreicht, die das Überleben der Bakterien nur unter bestimmten, von der Umgebung verschiedenen Bedingungen ermöglicht, wie Anwesenheit eines speziellen Reagenzes, Peptids oder bei einem bestimmten pH-Wert. Auf diese Weise ist das Überleben der Bakterien innerhalb des Materials begünstigt, wodurch kein Mutationsdruck aufgebaut wird. Gleichzeitig ist die Abhängigkeit von einer unbeschädigten, physischen Barriere verringert. ContainELMs wird unter Verwendung eines Modellbakteriums, E. coli, sowie eines nicht-modellhaften Lactobacillus-Stamms entwickelt, die jeweils von Interesse für Gesundheits- und Umweltanwendungen sind. Dabei wird das ELM aus Fasern gebildet, die durch Kombination von elektrohydrodynamischem Jetting, zur Herstellung eines für die Bakterien maßgeschneiderten Innenteils, mit chemischer Gasphasenabscheidung, zur Aufbringung einer Barriereschicht, geschaffen werden. Die Leistungsfähigkeit von ContainELMs wird für die Dauer von mindestens einem Monat überprüft werden, während des simulierten Einsatzes zur biologischen Sanierung von Flusswasser. Die durch ContainELMs entwickelten Methoden und Kenntnisse sollen eine breite Verwendung dieser materialzentrierten, aktiven Eindämmungsstrategie in allen Arten von Hybrid-ELMs ermöglichen.
Die Natur bietet hervorragende Konzepte zur schichtweisen Kombination von organischen und anorganischen Materialien, um mit effizientem Materialeinsatz High-Performance-Komposite zu gestalten. Durch das wechselweise Aufbringen von organischen/anorganischen Schichten auf die Carbonfaseroberfläche sollen im TP B03 (Scheffler) ähnliche Strukturen in der Verbundzone zwischen Carbonfaser und mineralischer Matrix erzeugt werden, um durch die gezielte Steuerung des Verbundspannungs-Schlupf-Verhaltens eine Erhöhung der Bruchzähigkeit des bewehrten Carbonbetonkomposits zu erzielen.
| Organisation | Count |
|---|---|
| Bund | 225 |
| Land | 5 |
| Weitere | 7 |
| Wissenschaft | 57 |
| Zivilgesellschaft | 11 |
| Type | Count |
|---|---|
| Förderprogramm | 220 |
| Text | 13 |
| unbekannt | 1 |
| License | Count |
|---|---|
| Geschlossen | 14 |
| Offen | 220 |
| Language | Count |
|---|---|
| Deutsch | 221 |
| Englisch | 33 |
| Resource type | Count |
|---|---|
| Bild | 2 |
| Dokument | 17 |
| Keine | 160 |
| Webseite | 69 |
| Topic | Count |
|---|---|
| Boden | 189 |
| Lebewesen und Lebensräume | 164 |
| Luft | 103 |
| Mensch und Umwelt | 234 |
| Wasser | 66 |
| Weitere | 224 |