Das Projekt "Weiterentwicklung des LCSA unter Einbeziehung einer spezifischen T-Zell-Antwort" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Charite Universitätsmedizin Berlin, Campus Benjamin Franklin, Institut für Klinische Pharmakologie und Toxikologie durchgeführt. LCSA steht für loose-fit coculture-based sensitization assay. Mit diesem vom Antragsteller entwickelten Testverfahren lässt sich in-vitro das irritative und sensibilisierende Potential von Testsubstanzen quantifizieren. Der Test basiert auf der Kokultur primärer humaner Keratinozyten und Dendritischer Zellen. Die Aktivierung von Dendritischen Zellen stellt nur die Initialphase der Sensibilisierung dar. Im weiteren Verlauf kommt es zur Aktivierung von T-Lymphozyten und erst damit zur Ausbildung einer Allergie. Eine Substanz, die zwar Dendritische Zellen aktiviert, aber keine T-Zell-Antwort auslöst, würde daher im LCSA falsch-positive Ergebnisse liefern. In der Weiterentwicklung des LCSA sollen im aktuellen Vorhaben T-Zell-Antworten als zusätzliche Endpunkte des Tests etabliert werden. Es sollen allogene T-Lymphozyten in das bestehende Testsystem integriert und nach Stimulation mit bekannten Allergenen über spezifische Antikörperfärbung differenziert und ihr Aktivierungsgrad bestimmt werden. Zudem soll eigenen experimentellen Hinweisen nachgegangen werden, nach denen auch die im LCSA bereits enthaltenen autologen T-Zellen über die Aktivierung der Keratinozyten zu einer Antwort stimuliert werden können.
Das Projekt "NanoGEM - Nanostrukturierte Materialien - Gesundheit, Exposition und Materialeigenschaften" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität des Saarlandes, Fachrichtung 8.2 Pharmazie, Professur für Biopharmazie und Pharmazeutische Technologie durchgeführt. 1. Vorhabenziel Inhalierte Nanopartikel treffen in der Lunge auf das sog. Alveolar Lining Fluid (ALF). Ziel des Teilprojekts ist die Untersuchung von Nanopartikeln unteschiedlicher Materialien bzw. Oberflächenbeschaffenheiten auf ihre Interaktion mit den Surfactant-Proteinen A-D, die das ALF enthält. Es soll die Proteinadsorption an Nanopartikel quantifiziert und mit bestimmten Oberflächeneigenschaften korreliert werden. Die Eignung eines Lab-on-a-chip-Systems als High-Throughput-Screening wird überprüft. Nach Anpassung eines Tripelkulturmodells an primäre humane Alveolarzellen unter Air-Interface-Bedingungen soll der Einfluss der Proteincorona von Nanopartikeln auf deren Aufnahme bzw. Transport mit diesem Modell bestimmt werden. Diese Untersuchungen sollen einen Beitrag zur toxikologischen Einschätzung von Nanopartikeln leisten. 2. Arbeitsplanung Ein geeignetes Modell für das ALF soll bestimmt und anschließend zur Konditionierung der Nanopartikel genutzt werden. Dabei kommen molekularbiologische als auch mikrofluidische Methoden zum Einsatz. Das Tripelkulturmodell, bestehend aus Dendiritischen Zellen, Macrophagen und A549-Zellen, wird an die Fragestellung angepasst. Mit Surfactant-Proteinen konditionierte Partikel werden aus der Aerosolphase heraus auf die Tripelkultur deponiert und mittels 2-Photonen-Mikroskopie detektiert und quantifiziert. Versuche mit nicht-konditionierten Partikeln sollen die Affinität von in der Tripelkultur enthaltenen Surfactant-Proteinen auf diese Partikel aufzeigen.
Das Projekt "Alternativmethoden: OpTest - Optimierte In-vitro-Testung von Fremdstoffen auf sensibilisierendes Potenzial durch CRISPR/Cas9-vermittelten Knockdown der inhibitorischen Moleküle PD-L1 und Arylhydrocarbon-(Ah)-Rezeptor in dendritischen Zellen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Charite Universitätsmedizin Berlin, Campus Benjamin Franklin, Institut für Klinische Pharmakologie und Toxikologie durchgeführt. In den letzten Jahren wurden verschiedene Zellkulturassays zur Untersuchung von Fremdstoffen auf ihr Potenzial entwickelt, Allergien nach Hautkontakt auszulösen. Diese Systeme bilden die Reifung dendritischer Zellen (DC) ab. Ein Problem aller Ansätze: Chemikalien können nur schwache Expressionsveränderungen von Reifungsmarkern auf DC in Kultur bewirken. Für eine starke Aktivierung mit einer gut messbaren Hochregulation von Aktivierungsmarkern ist nach neuesten Erkenntnissen eine Hemmung von sogenannten Inhibitionsmarkern notwendig. Von Interesse sind auch Forschungsergebnisse über den Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor (AhR). Der AhR wird von DC exprimiert und fungiert als Co-Inhibitor. Die o.g. Inihibitonsmarker sollen molekularbiologisch und mittels Antikörpern in der humanen DC-Linie MUTZ-3 ausgeschaltet oder blockiert werden, um die Hemmung der DC-Aktivierung zu durchbrechen. Die so behandelten MUTZ-3 werden in Kokultur mit Keratinozyten (HaCaT) eingesetzt. Als Kontaktallergene werden Modellsubstanzen verwendet, die in vivo und in vitro übereinstimmend als extrem, stark oder moderat sensibilisierend bzw. als negativ eingestuft wurden. In einer 2. Phase werden Kombinationen von spezifischem Knockdown mit Antikörperblockade untersucht, um Bedingungen zu identifizieren, bei denen die getesteten Kontaktallergene einen maximalen dynamischen Bereich in den Expressionswerten von Oberflächenmarkern und Zytokinen zeigen. In der dritten Phase werden die über Knockdown/Blockade inhibitorischer Moleküle behandelten MUTZ-3-Zellen mit naiven T-Zellen kokultiviert und überprüft, ob die T-Zellen sich teilen und spezifische Zytokine freisetzen.
Das Projekt "Development of an in vitro approach to evaluate the sensitizing potential of chemicals" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Bundesamt für Gesundheit durchgeführt. Es soll ein in vitro System zur Ermittlung des kontaktsensibilisierenden Potentials von Chemikalien (Haptenen) etabliert werden unter Einbezug der Metabolisierung der zu prüfenden Stoffe, was im Vergleich zu bestehenden prämilinären Systemen zu einer verbesserten Prädiktivität führen soll. Das Gesamtbudget für das 3-jährige Projekt, welches von einem Doktoranden durchgeführt wird, beträgt für Infrastruktur, Verbrauchsmaterial und Salär CHF 276'819.-. Das BAG sieht vor, dieses Projekt mit einem Betrag von CHF 135'000.- zu unterstützen.
Projektziele: Eine Kontaktsensibilisierung wird typischerweise durch kleinmolekulare Chemikalien (Haptene) verursacht. Solche Stoffe sind in Produkten für Industrie und Haushalt (z.B. Reinigungsmittel, Heimwerkerprodukte, Kosmetika) zu finden. Gegenwärtig wird das Kontaktsensibilisierungspotential von Chemikalien durch Tierversuche (Loca( lymph node assay in Mäusen oder Maximierungstest in Meerschweinchen) geprüft. Aus nachfolgenden Gründen drängt sich der Ersatz dieser Tierversuche durch validierte in vitro Methoden auf:
- Die 7. Änderung der EU Kosmetik-Direktive verbietet ab dem Jahr 2013 den Einsatz von Tieren für den Endpunkt Kontaktsensibilisierung gänzlich.
- Im Rahmen der zukünftigen europäischen Chemikaliengesetzgebung REACH ist die Ermittlung des kontaktsensibilisierenden Potentials von Stoffen mit einer Jahresproduktion von mehr als 1 Tonne vorgeschrieben. Davon sind rund 20'000 Chemikalien betroffen. Theoretisch ist eine
Kontaktsensibilisierung bei einer Vielzahl von Chemikalien denkbar. in der Praxis besitzt jedoch nur eine beschränkte Anzahl von Chemikalien ein kontaktsensibilisierendes Potential. Die gegenwärtigen in vitro Methoden mit immunkompetenten Zellsystemen der Haut erlauben noch keine verlässliche Voraussage. Das Zusammenwirken von verschiedenen Faktaren ist nach nicht ausreichend erforscht. Dazu gehören die Resorptian des Stoffes durch die Haut. die Metabolisierung in der Haut, die Bindung an körpereigene Proteine, die Aktivierung der dendritischen Zellen.
Das vorliegende Projekt hat zum Ziel, ein in vitro Testsystem zur Ermittlung des kontaktsensibilierenden Potentials von Chemikalien zu etablieren, welches den humanen Hautmetabolismus einschließt.