Das Projekt "Teilprojekt 1" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Göttingen, Institut für Pflanzenbau und Tierproduktion in den Tropen und Subtropen, Abteilung Tierhaltung und Tierzucht durchgeführt. Der Einsatz von Botulinum-Neurotoxinen (BoNT) als Therapeutikum kann durch Antikörper zunichte gemacht werden, deren neutralisierende Eigenschaften nicht durch serologische Tests sondern nur durch Tierversuche oder an Organen aus Tieren erfasst werden können. Als Ersatz wird ein Nachweis in neuronalen Zellkulturen entwickelt, der sich auch für die Chargenprüfung und Standardisierung der BoNT-Präparationen eignet. C. botulinum-Toxin A wird aus Referenzstämmen im Bioreaktor gewonnen. Durch Filtration und Säulenchromatographie werden unterschiedliche Reinheitsstufen dargestellt. Die gereinigten Toxine werden an Standardpräparationen abgeglichen und zur Lagerung eingefroren. Funktionsblockierende, polyklonale Seren gegen Toxin A werden in Ziegen propagiert, aufgereinigt, geprüft und als Referenzserum zur Verfügung gestellt. Das erarbeitete Nachweisverfahren soll als Patent angemeldet werden. Die im Rahmen eines ESF/EFRE-Projektes (EFRE Nr. 2002.128, ESF Nr. 2-VEC-00-0039) aus der Universität Göttingen gegründete Gesellschaft für mikrobiologische Diagnostik GmbH übernimmt die Verwertung des Testverfahrens, wobei beide Projektpartner angemessen beteiligt werden.
Das Projekt "Teilprojekt B" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Forschungszentrum Jülich GmbH, Institut für Bio-und Geowissenschaften (IBG), IBG-1: Biotechnologie durchgeführt. Das Pilotprojekt DynaMeTox dient zur Etablierung der instationären metabolischen Stoffflussanalyse in einem neuronalen zellulären System. Das Ziel ist es, den Einfluss von neurotoxischen Stoffen auf den Zellstoffwechsel in hoher zeitlicher Auflösung quantitativ zu bestimmen. Somit soll die primäre metabolische Antwort von neuronalen Zellen von der adaptiven Stoffwechsel Antwort unterschieden werden um die Wechselwirkung zwischen dem Stoffwechsel und dem genregulatorischen Netzwerk zu entflechten. Im Anschluss an die Pilotphase sollen die etablierten Methoden automatisiert und in einem größeren Umfang eingesetzt werden. Zunächst soll das metabolische Netzwerk der verwendeten neuronalen Zelllinien formuliert und mittels proteomischer und metabolomischer Studien validiert werden. Besonderer Fokus wird auf die metabolische Antwort des primären Stoffwechsels (Glykolyse, Zitrat-Zyklus, der Pentose-Phosphatweg, die Aminosäure-Synthese sowie die oxidative Phosphorylierung) gelegt. Isotopenaufgelöste Metabolomics-Daten werden mittels State-of-the-Art Methoden der 13C-Stofflussanalyse basierend auf mathematischen Modellen analysiert und quantitative Fluxom-Karten erstellt. Darauf aufbauend wird das Potential der Modellierung für das Verständnis der Neurotoxozität durch Stoffwechselveränderungen untersucht. Dieser Schritt wird durch zielgerichtete Versuchsplanungsstudien begleitet.
Das Projekt "Teilprojekt 2" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Physiologisches Institut durchgeführt. Der Einsatz von Botulinum-Neurotoxinen (BoNT) als Therapeutikum kann durch Antikörper zunichte gemacht werden, deren biologisches Potenzial nicht durch serologische Tests sondern nur durch Tierversuche unterschieden werden können. Als Ersatz wird ein Nachweis in neuronalen Zellkulturen entwickelt, der sich auch für die Chargenprüfung und Standardisierung der BoNT-Präparationen eignet. Zellkulturtechniken werden optimiert, um aus den Vorläuferzellen der NT-2-Tetrakarzinom-Linie sowohl Neuronen als auch Gliazellen mit einem möglichst hohen Anteil an cholinergen Synapsen zu erhalten. In einem bildgebenden Messverfahren werden die Synapsen mit dem Styrylfarbstoff FM-143 intravesikulär geladen, um die synaptische Vesikelfreisetzung sichtbar zu machen. Diese wird fotomikroskopisch dokumentiert und quantifiziert. Das erarbeitete Nachweisverfahren soll als Patent angemeldet werden. Die im Rahmen eines ESF/EFRE-Projektes (EFRE Nr. 2002.128, ESF Nr. 2-VEC-00-0039) aus der Universität Göttingen gegründete Gesellschaft für mikrobiologische Diagnostik GmbH übernimmt die Herstellung und Vermarktung des Testkits, wobei beide Projektpartner angemessen beteiligt werden.
Das Projekt "Teilprojekt C" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Konstanz, Lehrstuhl für in vitro Toxikologie und Biomedizin durchgeführt. Das Pilotprojekt DynaMeTox dient zur Etablierung der instationären metabolischen Stoffflussanalyse in einem neuronalen zellulären System. Das Ziel dieser Analysen ist es, den Einfluss von neurotoxischen Stoffen auf den zellulären Stoffwechsel in hoher zeitlicher Auflösung quantitativ zu bestimmen. Somit soll die primäre metabolische Antwort von neuronalen Zellen von der adaptiven Stoffwechsel Antwort unterschieden werden. Zum einen lässt sich somit die Toxinwirkung genauer beschreiben und zum anderen soll es möglich sein die Wechselwirkung zwischen dem Stoffwechsel und dem genregulatorischen Netzwerk zu entflechten. Im Anschluss an die Pilotphase sollen die etablierten Methoden automatisiert und in einem größeren Umfang eingesetzt werden um eine große Anzahl an chemischen Substanzen auf ihre Toxinwirkung hin zu untersuchen. Zu Beginn des Projektes soll das metabolische Netzwerk der verwendeten neuronalen Zelllinien validiert werden. Hierfür werden wir proteomische und metabolomische Untersuchungen durchführen. Die 'isoformaufgelösten' Protein-Daten werden für die Validierung der Topologie des metabolischen Netzwerkes verwendet. Im Weiteren wird das System hinsichtlich der Dynamik der metabolischen Antwort mit toxischen Substanzen kalibriert. Stabil-Isotopen aufgelöste Metabolomicsanalysen (pSIRM) sollen die Dynamik der Stoffwechselantwort sichtbar machen.
Das Projekt "Rezeptor-basierte Diagnostika für BoNT/E" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Toxikologie durchgeführt. Die lebensbedrohliche, meldepflichtige Erkrankung Botulismus wird durch die Aufnahme der hochwirksamen Botulinum Neurotoxine (BoNT) ausgelöst. Die Diagnostik der Erkrankung erfolgt nach DIN 10102 mit dem schwer belastenden Maus-Bioassay, für den in Deutschland ca. 6000 Mäuse pro Jahr verwendet werden. Eine Tierversuchsersatzmethode für die Botulismus-Diagnostik muss Spuren der humanpathogenen Serotypen BoNT/A, B, E, F und H mit ihren 38 Subtypen sicher aus komplexen Proben erfassen können - eine bislang ungelöste Herausforderung. Ziel dieses Teilvorhabens ‚Rezeptor-basierte Diagnostika für BoNT/E‘ der MHH ist es, für ein innovatives in vitro-Verfahren zum simultanen Nachweis von BoNT/A+B wesentliche Komponenten für ein Kit-Labormuster zu optimieren und in für die Durchführung von zwei multizentrischen Vergleichsstudien hinreichenden Mengen herzustellen. Parallel befasst sich die MHH zur vollen Ausschöpfung des 3R-Potentials mit der Optimierung Rezeptor-basierter Diagnostika für BoNT/E zur späteren internen Validierung des aus Vorarbeiten bereitstehenden BoNT/E-spezifischen Assays.
Das Projekt "Expressed Sequence Tags (ESTS) of Toxic Algae (ESTTAL)" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Stiftung Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung e.V. in der Helmholtz-Gemeinschaft (AWI) durchgeführt. Harmful algal blooms (HABs) are caused by local proliferation of algae, with deleterious consequences, particularly in coastal waters throughout the world. Negative environmental effects include toxicity to human consumers of seafood, marine faunal mortalities or morbidity, habitat damage, disruption of marine food webs and economic losses to fishing, aquaculture, and tourism. In Europe, socio-economic factors and human health risk have led to comprehensive surveillance programmes for harmful microalgae and their toxins. Among harmful microalgae and cyanobacteria in European marine and brackish waters, many produce potent neurotoxins, ichthyotoxins or hepatotoxins. Although structural elucidation of many of these groups of toxins has advanced, much less is known about biosynthetic pathways and gene regulation in toxigenic species. We propose a limited genomic study of expressed sequence tags (ESTs) for toxigenic representatives of major eukaryotic microalgal groups, including dinoflagellates, raphidophytes, prymnesiophytes and diatoms, and cyanobacteria. Cultures will be grown under various environmental conditions to investigate the effects of external forcing functions on gene expression linked to toxicity and growth. After cloning of cDNA of toxigenic strains pooled from cultures grown under these different conditions into plasmid vectors, about 10,000 clones from each taxon will be randomly sequenced for ESTs. Our approach is to annotate the ESTs and attempt to identify genes associated with toxin production. DNA microarrays will be developed for screening of toxigenic and non-toxigenic strains. In addition, the sequence data will be analysed to identify other genes that may be involved in cell regulation or growth, cell cycle events, stress response and the induction of sexuality. Cultures will be grown under various environmental conditions to investigate the effects of external forcing functions on gene expression linked to toxicity and growth. Successful completion of this project will yield new information on microalgal and cyanobacterial genomic sequences for a diversity of taxa and will assist in the diagnosis of genes related to toxin biosynthesis and the formation of toxic blooms.
Das Projekt "Teilprojekt A" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft durchgeführt. Das Pilotprojekt DynaMeTox dient zur Etablierung der instationären metabolischen Stoffflussanalyse in einem neuronalen zellulären System. Das Ziel dieser Analysen ist es, den Einfluss von neurotoxischen Stoffen auf den zellulären Stoffwechsel in hoher zeitlicher Auflösung quantitativ zu bestimmen. Somit soll die primäre metabolische Antwort von neuronalen Zellen von der adaptiven Stoffwechselantwort unterschieden werden. Zum einen lässt sich somit die Toxinwirkung genauer beschreiben und zum anderen soll es möglich sein die Wechselwirkung zwischen dem Stoffwechsel und dem genregulatorischen Netzwerk zu entflechten. Im Anschluss an die Pilotphase sollen die etablierten Methoden automatisiert und in einem größeren Umfang eingesetzt werden um eine große Anzahl an chemischen Substanzen auf ihre Toxinwirkung hin zu untersuchen Speziell neuronale Zellen sind energetisch hoch aktiv und Störungen des zentralen Stoffwechsels sind Ursache oder Symptom von Neurodegeneration. Zu Beginn des Projektes soll das metabolische Netzwerk der verwendeten neuronalen Zelllinien validiert werden. Hierfür werden wir proteomische und metabolomische Untersuchungen durchführen. Die 'isoformaufgelösten' Protein-Daten werden für die Validierung der Topologie des metabolischen Netzwerkes verwendet. Im Weiteren wird das System hinsichtlich der Dynamik der metabolischen Antwort mit toxischen Substanzen kalibriert. Stabil-Isotopen aufgelöste Metabolomicsanalysen(pSIRM) sollen die Dynamik der Stoffwechselantwort sichtbar machen.
Das Projekt "Teilprojekt 6" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung GmbH - UFZ - Fachbereich Analytik und Ökotoxikologie - Department Bioanalytische Ökotoxikologie durchgeführt. In Teilprojekt 6 sollen 3 Ziele erreicht werden, die einen Beitrag zur Beurteilung der Risiken von potentiell neuroaktiven Oberflächen- und Trinkwasserkontaminationen im Rahmen des GOW- Konzeptes leisten. Zum einen sollen durch wirkungsorientierte Analytik und differentieller Analyse unter Nutzung von Embryonen des Zebrabärblings (Danio rerio) neuroaktive Substanzen aus realen wässrigen Umweltproben isoliert und identifiziert werden. Zweitens sollen synthetische Mischungen von identifizierten Wasserkontaminanten auf ihre möglichen Effekte in den Fischembryonen untersucht werden. Dabei werden die zwei Haupttheorien für Kombinationswirkungsprognosen nämlich der 'Konzentrationsadditivität' sowie der 'unabhängigen Wirkung' als Grundlage der Mischungsbetrachtung genutzt. Die Ergebnisse werden für Empfehlungen für die Betrachtung und Bewertung von Mischungseffekten für das GOW-Konzept zusammengestellt. Drittens soll begleitend zu den o.g. Analysen synthetischer Mischungen die interne Konzentration der identifizierten Substanzen in den Fischembryonen quantifiziert werden und dabei bestimmt werden, ob, wann, in welcher Form und in welchem Umfang die Fischembryonen in der Lage sind, neuroaktive Substanzen zu biotransformieren und damit zu bioaktivieren oder zu entgiften. Die Arbeiten gliedern sich auf in die 3 Arbeitspakete Differentialanalyse und Monitoring (AP1), Analyse der Mischungstoxizität (AP2) und interne Konzentration und Biotransformation (AP3). Das AP1 ist über den Zeitraum der ersten 2 Jahre des Projektes veranschlagt. Die anderen beiden APs werden über den gesamten beantragten Zeitraum bearbeitet, wobei sich das AP 3 auf die letzten Monate des Projektes konzentriert. Wesentliche übergreifende Arbeitsschritte sind eine Stoffauswahl der darauf experimentell zu prüfenden Substanzen und deren Mischungen, die Etablierung der Analytik in den Embryonen und der Untersuchung der verschiedenen neuroaktiven Effekte in den Embryonen.
Das Projekt "Teilprojekt 2" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Toxikologie durchgeführt. Die Detektion von Botulinum Neurotoxinen (BoNT) ist aufgrund ihrer hohen Toxizität und der zahlreichen Toxinvarianten (7 Serotypen, mehr als 35 Subtypen) außerordentlich schwierig. Als Goldstandard zur Diagnostik von Botulismus-Verdachtsproben gilt der nach DIN10102 vorgeschriebene Mausbioassay. Hierfür werden nach Schätzungen des RKI pro Jahr in Deutschland 8.000-10.000 Mäuse benötigt. Ziel des Kooperationsprojekts des Robert Koch-Instituts und der Medizinischen Hochschule Hannover ist die Erforschung eines innovativen, hochsensitiven in vitro-Verfahrens zum funktionellen und immunologischen Nachweis aller BoNT-Moleküle aus Realproben und dessen Etablierung, um den Mausbioassay im Rahmen der Botulismusdiagnostik zu ersetzen. Im Projekt werden maßgeschneiderte Bindungsmoleküle konstruiert, um verschiedene Aspekte der funktionellen Aktivität von BoNT in einem Multiplex-Suspensionsarray in vitro zu erfassen. Das Verfahren, das für die Anwendung im mikrobiologisch-klinischen Routinelabor geeignet ist, wird gegenüber etablierten Methoden zur funktionellen Detektion von BoNT prävalidiert. Die Realisierung des Vorhabens stellt einen wichtigen Beitrag zur komplexen Diagnostik von Botulismus dar und wird im Sinne des 3R-Konzepts dazu beitragen, Tierversuche im Bereich Botulismusdiagnostik durch ein in-vitro-Verfahren zu ersetzen.
Das Projekt "Schulung, Verbreitung und Validierung" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Robert Koch-Institut durchgeführt. Die lebensbedrohliche, meldepflichtige Erkrankung Botulismus wird durch die Aufnahme der hochwirksamen Botulinum Neurotoxine (BoNT) ausgelöst. Die Diagnostik der Erkrankung erfolgt derzeit mit dem regulatorisch vorgeschriebenen, schwer belastenden Maus-Bioassay, für den in Deutschland etwa 6000 Mäuse pro Jahr verwendet werden. Eine Tierversuchsersatzmethode für die Botulismus-Diagnostik muss Spuren von Toxinen aus komplexen Proben sicher erfassen können. Dies trifft insbesondere auf die für den Menschen pathogenen und somit Botulismus hervorrufenden Serotypen BoNT/A, B, E, F und H mit ihren 38 Subtypen zu. Das ist derzeit noch ein ungelöstes Problem. Ziel des ImpliBoNT-Projektes ist es ein innovatives In-vitro-Verfahren zum simultanen Nachweis von BoNT/A+B zu implementieren, Nutzende zu schulen und die Methode zu verbreiten. Das Verfahren wird im Konsortium etabliert und validiert. Im Jahr 2021 wurde das Projekt mit dem 3. Hamburger Forschungspreis für Alternativmethoden zum Tierversuch prämiert. Parallel werden weitere, bereits existierende Assays zum Nachweis von BoNT/E+F bzw. H validiert. Das Prinzip der innovativen Methode beruht auf der spezifischen Anreicherung der Toxine und der Messung spezifischer Schnittfragmente in einer Lösung dank hochspezifischer Antikörper. Mittel- bis langfristig möchten die Projektinitiatoren das Verfahren für den Lebensmittelbereich standardisieren sowie die CE-Konformität für die humane Diagnostik erlangen. Das Vorhaben liefert einen zentralen Beitrag, um die aktuell bestehenden Defizite in der komplexen BoNT-Diagnostik zu beheben und eine umfassend validierte Methode als Ersatz für die Tierversuche in mikrobiologischen Routinelaboren zu bringen.