Das Projekt "Teilprojekt B" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universitätsklinikum Essen (AöR), Institut für Medizinische Strahlenbiologie durchgeführt. Ziel des vorliegenden Projektes ist es den Einfluss der Chromatinstruktur auf die Funktion des B-NHEJ zu untersuchen und zu testen inwiefern die starke Einschränkung dieses Reparaturweges, die in G0 Zellen beobachtet wird, auf die Kondensierung des Chromatins zurückzuführen ist. Folgende Aspekte werden untersucht: Die Kondensierung des Chromatins in G0 Zellen durch DAPI Färbung in Kombination mit quant. Bildanalyse. Der Einfluss von Änderungen der Chromatinstruktur durch hypotonische Behandlung auf den B-NHEJ in G0-Zellen. Die Zusammenhänge zwischen Änderung der DNA Methylierung und Chromatin Kondensierung. Dafür wird die Behandlung mit 5-Aza-C durch DAPI Färbung und Messung der B-NHEJ Aktivität optimiert. Unter optimierten Bedingungen wird die DNA Methylierung mittels Elisa bestimmt, durch Sequenzierung von Bisulfit modifizierter DNA in Gruppen von 3-6 CpGs verifiziert und der Methylierungsstatus der DNA in Promotorbereichen quant. durch Methylierungsprofil-Chips erfasst. Der Methylierungsstatus von G0 und G1 Zellen wird untereinander und mit Parametern, die die B-NHEJ Aktivität beeinflussen verglichen. Der Einfluss von miRNAs der DNMT1 auf die Aktivität von B-NHEJ wird erfasst. Die Auswirkungen von Proteinen der HP1 Familie wird durch Überexpression und Suppression mittels RNA-Interferenz auf die B-NHEJ Aktivität bestimmt. Da Zellen mit Defekten in DNA-PKcs keine Hemmung von B-NHEJ in G0 zeigen, sollen die Wechselwirkungen von DNA-PK auf die Chromatinstruktur analysiert werden.
Das Projekt "Teilprojekt C" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Technische Universität Darmstadt, Radiation Biology and DNA Repair, AG Löbrich durchgeführt. Der Schwerpunkt des Projektes liegt auf der Untersuchung der Chromatindynamik während der Homologen Rekombination in der G2-Phase und inwieweit der Chromatinstatus die Kontrolle des Zellzyklus beeinträchtigt. Es soll somit ein Beitrag zum besseren Verständnis der Entstehung von Chromosomenaberrationen und chromosomalen Instabilitäten geleistet werden. Ein weiterer Aspekt des Projekts soll auf der Untersuchung der HR-assoziierten Vorgänge in der Mitose liegen. Hierbei stellt sich die Frage, welche HR-Intermediate die Mitose durchlaufen und welches Schicksal diese Zellen im darauf folgenden Zellzyklus erfahren. Begonnen wird mit der Charakterisierung von Chromatinremodellierern während der HR mittels zellbiologischer, molekularbiologischer und biochemischer Methoden. Parallel dazu wird die Herstellung von Knock-out Zelllinien, sowie die Expression und Aufreinigung der zu untersuchenden Proteine durchgeführt. Im nächsten Schritt ist die Etablierung und Durchführung von in-vitro Studien zur Chromatin-remodellierenden Aktivität vorgesehen. Abschließend soll der Einfluss der Chromatinremodellierer und somit des Chromatinstatus auf die Sensitivität des G2/M Checkpoints untersucht werden. Diese Untersuchungen umfassen zudem die Analyse von strahleninduzierten Chromosomenaberrationen.
Das Projekt "Teilprojekt A" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von GSI Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung GmbH durchgeführt. Das Hauptziel des Vorhabens ist die Aufklärung der grundlegenden Mechanismen der frühen Prozessierung heterochromatischer DNA Schäden, um so die zellulären Auswirkungen einer fehlerhaften Reparatur im HC besser abschätzen zu können. Im Besonderen soll die Rolle der nach Ionenbestrahlung in Heterochromatin gefundenen lokalen Dekondensation und Relokalisation der Schäden in der Reparatur untersucht werden. Verschiedene Schwerpunkte des Einflusses der Schadenskomplexität auf die Prozessierung von DNA DSBs im Kontext der Kernarchitektur werden im Verbund von einem HGF Laboratorium und zwei universitären Partnern bearbeitet. Die räumliche und zeitliche Koordination von Reparaturfaktoren an DNA Schäden nach Röntgen - bzw. dicht ionisierenden Teilchenstrahlen wird an den Strahlplätzen der GSI mit innovativsten Bestrahlungstechnologien und hochauflösender Lebendzell-Mikroskopie untersucht. Parallel verlaufende molekularbiologische Arbeiten erlauben einen Einblick und auch einen Eingriff in die molekularen Abläufe der frühen Prozessierung. Neue Fluoreszenztechniken wie z.B. FLIM (fluorescence lifetime imaging) werden am Strahlplatz etabliert um dynamische Prozesse der lokalen Schadensantwort im Kontext der Chromatinstruktur zu messen.