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Biologische und chemisch-analytische Charakterisierung des allergenen Potentials von Terpenen, Terpenmetaboliten und Terpenoxidationsprodukten

Die zunehmende Verwendung von Monoterpenen wie vor allem d-Limonen, a-, b-Pinen, 3-Caren und a-Terpinen in Produkten aus dem Bereich der Körperpflege, terpenhaltigen Medikamenten, sowie der vermehrte Einsatz von terpenhaltigen Naturstoffen als Baumaterialien in Innenräumen bildet möglicherweise eine wesentliche Ursache für das steigende Auftreten der entsprechenden Sensibilisierungen. Zwischen 1995 und 1999 stieg die Anzahl der sensibilisierten Patienten von 0,5 auf 2,9 Prozent. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind wenig verstanden. In diesem Forschungsvorhaben sollen vergleichende in vitro und in vivo Untersuchungen Ansätze zur Klärung dieses sozialmedizinisch bedeutsamen Problems liefern. Exemplarisch sollen hierzu die Terpene, a-Terpene, d-Limonen und 3-Caren auf ihr allergenes Potential für Blutleukozyten bzw. T-Lymphozyten der Haut auf polyklonaler und monoklonaler Ebene analysiert werden. Daneben soll die transiente Genexpression durch die Substanzen in Antigen-präsentierenden Zellen ermittelt werden und gleichzeitig die dafür relevanten Metabolite und Oxidationsprodukte identifiziert werden. Dabei soll geklärt werden, welchen Anteil einzelne Metabolite und Oxidationsprodukte bzw. Kombinationseffekte im Vergleich zu den Ausgangssubstanzen an den in vivo Befunden haben. Diese Untersuchungen werden grundlegende Hinweise zum Wirkmechanismus der Substanzen liefern und dadurch Ansätze für die Bewertung der gesundheitlichen Auswirkungen von Monoterpenexpositionen in umweltrelevanten Konzentrationen bieten.

Alternativmethoden - Einzelprojekt: B-CELL-ACT - Funktionstest für die B-Zellaktivierung durch Toxoidimpfstoffe

Entwicklung spezieller Antikörper für ein Immuno-Assay zum Nachweis und zur Differenzierung der Amerikanischen Faulbrut (ANDI)

Entwicklung von Probenaufbereitungsstragien für ein Immuno-Assay zum Nachweis und zur Differenzierung der Amerikanischen Faulbrut (ANDI)

Kulturunabhängige Detektionssysteme zur schnellen Risikobewertung anthropogen verursachten aerogenen Legionellenexpositionen (LegioTyper), Teilvorhaben: Bereitstellung und Charakterisierung eines Panels monoklonaler Antikörper gegen Legionella pneumophila zur Serotypisierung und Antigenbestimmung

Legionellen sind ubiquitär vorkommende Wasserbakterien. Sie können sich insbesondere im Bereich von 30-45° C sehr gut in künstlichen Wassersystemen vermehren. Werden sie als Aerosol auf den Menschen übertragen und von empfänglichen Personen eingeatmet, so kann es zu Legionella bedingten Pneumonien kommen. Diese sind meist sporadische Einzelinfektionen, selten epidemische Ausbrüche. Bei der Untersuchung der letzten Legionella- Epidemien in Warstein und in Ulm zeigte sich die Notwendigkeit, das Ausbruchsmanagements zu verbessern. Zentraler Bestandteil dieses, ist ein sensitiver und spezifischer Schnelltest auf der unserer monoklonalen Antikörper (mAk) zum Vergleich von Patienten ( Urin )und Umweltproben (Wasser aus verschiedenen Umweltquellen). Diese Antikörper werden umfänglich hinsichtlich ihrer Spezifität und Eignung für den neuen Test validiert. Letzteres ist deshalb extrem wichtig, da in einem Wassersystem unterschiedliche Legionella Stämme (Spezies , L. pneumophila Serogrupppen, monoklonale Subgruppen) auftreten können. Bei Übereinstimmung von Patienten und Umweltproben kann von einer Übertragung aus dem gegebenen Wassersystem ausgegangen werden. Damit wird es möglich, schnell notwendig antiepidemische Maßnahmen zu ergreifen.

Entwicklung einer in-vitro Methodik zum Ersatz des gesetzlich geforderten Tierversuches zur Prüfung von Rindertuberkulin

Nanopore Sensing

Nanofabricated pores in 20 nm-thick silicon nitride membranes were used to probe various protein analytes as well as to perform an antigen-antibody binding assay. A two-compartment electrochemical cell was separated by a single nanopore, 28 nm in diameter. Adding proteins to one compartment caused current perturbations in the ion current flowing through the pore. These perturbations correlated with both the charge and the size of the protein or of a protein-protein complex. The potential of this nanotechnology for studying protein-protein interactions is highlighted with the sensitive detection of -human chorionic gonadotropin, a hormone and clinical biomarker of pregnancy, by monitoring in real time and at a molecular level the formation of a complex between hormones and antibodies in solution. In this form, the assay compared advantageously to immunoassays, with the important difference that labels, immobilization, or amplification steps were no longer needed. In conclusion, we present proof-of-principle that properties of proteins and their interactions can be investigated in solution using synthetic nanopores and that these interactions can be exploited to measure protein concentrations accurately.

Chemische und biologische Untersuchungen zum allergenen Potential von Terpenen, Terpenmetaboliten und Terpenoxidationsprodukten

Die zunehmende Verwendung von Monoterpenen wie vor allem d-Limonen, -, -Pinen, 3-Caren und -Terpinen in Produkten aus dem Bereich der Körperpflege, terpenhaltigen Medikamenten, sowie der vermehrte Einsatz von terpenhaltigen Naturstoffen als Baumaterialien in Innenräumen bildet möglicherweise eine wesentliche Ursache für das steigende Auftreten der entsprechenden Sensibilisierungen. Zwischen 1995 und 1999 stieg die Anzahl der sensibilisierten Patienten von 0,5 auf 2,9 Prozent. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind wenig verstanden. In diesem Forschungsvorhaben sollen vergleichende in vitro und in vivo Untersuchungen Ansätze zur Klärung dieses sozialmedizinisch bedeutsamen Problems liefern. Exemplarisch sollen hierzu die Terpene - Terpinen, d-Limonen und 3-Caren auf ihr allergenes Potential für Blutleukozyten bzw. T-Lymphozyten der Haut auf polyklonaler und monoklonaler Ebene analysiert werden. Daneben soll die transiente Genexpression durch die Substanzen in Antigen-präsentierenden Zellen ermittelt werden und gleichzeitig die dafür relevanten Metabolite bzw. Oxidationsprodukte identifiziert werden. Dabei soll geklärt werden, welchen Anteil jeweils die Terpene selbst, einzelne Metabolite und Oxidationsprodukte oder Kombinationseffekte ursächlich an der enormen Steigerung der in vivo Befunde beteiligt sind. Diese Untersuchungen werden grundlegende Hinweise zum Wirkmechanismus der Substanzen liefern und dadurch Ansätze für die Bewertung der gesundheitlichen Auswirkungen von Monoterpenexpositionen in umweltrelevanten Konzentrationen bieten.

FP4-ENV 2C, Integrated Immuno Extraction Sampling and Portable Biosensor Prototype for In-Field Monitoring

General Information: Phenols, surfactants and metabolites (e.g. phenolic derivatives) present in surface, waste and ground water are an increasing environmental problem all over Europe. Due to the extreme amounts of surfactants emitted into sewage plants, the fact that these cannot be completely mineralised in biological waste water treatment plants and the persistence of some of the known metabolites make them the group of environmental pollutants with the highest priority (Council Directives 73/404, 76/464 and its six daughters). Most of the metabolites as well as their toxic effects are unknown up to now because of a lack of analytical methods. In order to address the environmental problems there is thus a strong need for new and selective analytical techniques, permitting the specific and sensitive determination of various phenols and surfactants both in-field as an early warning system, but also in the laboratory for the identification of new metabolites of the latter. The fact that trace levels already prove to be harmful demonstrates that the more sensitive a method, the earlier a warning signal can be given. The present project deals with one of the possible ways to address these problems by development of an immuno based in-field sampling device based on supported liquid membranes (SLM) coupled on-line to a biosensor flow module by implementing: 1) antibody recognition of target analytes already during sampling, 2) isolation of bound or free labelled antigen/antibody in continuous immuno flow systems and 3) monitoring of the eluting labelled target by a biosensor (amplified label monitor) based on a bioelelectrocatalytic or bi-enzymatic approach. As an ultimate goal, the biosensor flow module (immuno flow system combined with amplified label monitor) will be housed in a biosensor prototype containing disposable and easily exchangeable biological units, designed for simple on-line coupling to the stand alone SLM sampling device for in-field monitoring of phenols, surfactants and metabolites. The proposer's research developments will answer to the increasing demand for more straightforward instrumentation, improved simplicity, selectivity, and low cost, cumbersome sample pre-treatment will not be necessary due to the very selective clean-up during the immuno based sampling step. The prototype will be constructed so that the technology can be easily transferred and applied in other areas than surfactant and phenol monitoring. Prime Contractor: Lund University, Analytisk Kemi - Matematisk-Naturvetenskapliga Fakulteten; Lund/Sweden.

Eignungsprüfung eines Antigen-ELISA als Ersatzmethode zur Wirksamkeitsprüfung von AEV-Geflügelimpfstoffen

Ziel ist es, den im Arzneibuch vorgeschriebenen Tierversuch (Schlupftest) durch einen Antigen-ELISA zu ersetzen. Bei Eignung des ELISA soll eine Machbarkeitsstudie mit weiteren Laboren erfolgen, um die Aufnahme der Methode ins Europäische Arzneibuch beantragen zu können. Der Virusgehalt (Titer) von AE-Impfstoffen wird bisher im Tierversuch im sogenannten 'Schlupftest' bestimmt. Es soll geprüft werden, ob die quantitative Antigenbestimmung mittels eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) geeignet ist, den mit der Virustitration verbundenen Tierversuch (Schlupf der inokulierten embryonierten SPF-Hühnereier - Schlupftest) zu ersetzen. Um den in vivo-Schlupftest durch eine in vitro-Antigen-Quantifizierung zu ersetzen, muss der im ELISA bestimmte Antigengehalt mit dem Virustiter korrelieren. Sollte ein stabiles Verhältnis zwischen Antigengehalt und Virustiter über die Laufzeit des Impfstoffes vorliegen, kann ganz auf die Virustitration in SPF-Hühnereiern verzichtet werden. Der derzeit verwendete Schlupftest wurde nie validiert. Die im Rahmen dieses Projektes notwendigen Virustitrationen sollen daher auch im Sinne des 3R-Konzeptes ohne Schlupftest erfolgen. Die Virusvermehrung wird mittels ELISA und PCR nachgewiesen. Um die Aussagekraft dieser Virustitrationen zu belegen, werden Daten zur Reproduzierbarkeit erhoben. Bei Eignung: Einführung der Methode bei Impfstoffherstellern oder Prüflaboratorien im Rahmen der Chargenprüfung oder der Inprozeßkontrolle. Aufnahme als Alternativmethode ins Europäische Arzneibuch.

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