Das Projekt "Teilprojekt A" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Potsdam, Institut für Ernährungswissenschaft, Lehrstuhl für Biochemie der Ernährung (BCE) durchgeführt. Botulinumtoxin wird zur Behandlung von Krankheiten sowie in der ästhetischen Medizin eingesetzt. Obwohl Alternativen existieren, wird die Aktivität des aus C. Botulinum Kulturen gereinigten Neurotoxins meist über einen Maus-Letalitäts-Test bestimmt. Bei Vorarbeiten wurden neuronale Tumorzelllinien entwickelt, in denen die Stimulus-abhängige Freisetzung eines in neurosekretorische Vesikel umgeleiteten Reporterenzyms durch Botulinumtoxin gehemmt wurde. Das System ist grundsätzlichen für die Bestimmung der Botulinumtoxinaktivität geeignet, weist aber noch Nachteile auf. Die empfindlichsten Zielstrukturen des Botulinumtoxins im Menschen sind Motoneurone. Daher soll das in den Vorarbeiten entwickelte Reportersystem in transgene humane Motoneurone eingebracht werden, die aus neuronalen (NSCs) oder induzierten pluripotenten humanen Stammzellen (hiPSCs) (MN) differenziert werden. Damit könnten die Vorteile beider Systeme, die hohe Empfindlichkeit der aus Stammzellen differenzierten Neurone sowie das universell anwendbare und technisch einfache Nachweissystem in einem Testsystem kombiniert werden. Ziel ist es, mit diesen Zellen einen praxistauglichen Test zu entwickeln, der die Bestimmung der Aktivität von Botulinumtoxin in pharmazeutischen Zubereitungen erlaubt und ein Alternativverfahren zum Maus-Letalitäts-Assay darstellt. Mit schon existierenden Zellen wird geprüft, ob das Testsystems für den Nachweis von Botulinumtoxin in pharmakologischen Zubereitungen geeignet ist. In schon etablierten Klonen wird geprüft ob andere Reporterkonstrukte für ein Testsystem besser geeignet sind. Es wird geprüft ob durch Überexpression oder Ausschaltung von Botulinumtoxin-Zielproteinen die Empfindlichkeit gegenüber Botulinumtoxin beeinflusst wird. Es werden Vektoren zum Einführen des Reporters in Stammzellen hergestellt und stabile transgene Stammzellklone etabliert. Nach Differenzierung dieser Stammzellklone in Motorneurone wird das Testverfahren etabliert und validiert.
Das Projekt "Teilprojekt B" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik durchgeführt. Botulinumtoxin wird zur Behandlung von Krankheiten sowie in der ästhetischen Medizin eingesetzt. Obwohl Alternativen existieren, wird die Aktivität des aus C. Botulinum- Kulturen gereinigten Neurotoxins meist über einen Maus-Letalitäts-Test bestimmt. Bei Vorarbeiten wurden neuronale Tumorzelllinien entwickelt, in denen die Stimulus-abhängige Freisetzung eines in neurosekretorische Vesikel umgeleiteten Reporterenzyms durch Botulinumtoxin gehemmt wurde. Das System ist grundsätzlichen für die Bestimmung der Botulinumtoxinaktivität geeignet, weist aber noch Nachteile auf. Die empfindlichsten Zielstrukturen des Botulinumtoxins im Menschen sind Motoneurone. Daher soll das in den Vorarbeiten entwickelte Reportersystem in transgene humane Motoneurone (MNs) eingebracht werden, die aus neuronalen (NSCs) oder induzierten pluripotenten humanen Stammzellen (hiPSCs) differenziert werden. Damit könnten die Vorteile beider Systeme, die hohe Empfindlichkeit der aus Stammzellen differenzierten Neurone sowie das universell anwendbare und technisch einfache Nachweissystem, in einem Testsystem kombiniert werden. Ziel ist es, mit diesen Zellen einen praxistauglichen Test zu entwickeln, der die Bestimmung der Aktivität von Botulinumtoxin in pharmazeutischen Zubereitungen erlaubt und ein Alternativverfahren zum Maus-Letalitäts-Assay darstellt. 1) Testung unterschiedlicher Differenzierungsprotokolle und Stammzellen; 2) Charakterisierung der differenzierten Zellen bezüglich der Expression der als relevant identifizierten Botulinumtoxin-Targets; 3) Differenzierung nach den zuvor etablierten Protokollen der in Potsdam hergestellten transgenen Stammzellen, die das Reporterkonstrukt im AAVS1-Lokus integriert haben; 4) Stimulus-abhängige Freisetzung des Reporters ist in den aus transgenen Stammzellen differenzierten Motorneuronen 5) Validierung des Testsystems mit den neu etablierten Zellen an den Standorten Potsdam und Hannover von unabhängigen Experimentatoren.
Das Projekt "Biogas: Abundanz und Vielfalt von Clostridien in landwirtschaftlichen Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung von Clostridium botulinum" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von HAWK Hochschule für angewandte Wissenschaft und Kunst - Hildesheim,Holzminden,Göttingen, Fachgebiet Nachhaltige Energie- und Umwelttechnik NEUTec durchgeführt. 1. The substrates, cattle manure, pig manure or maize silage contained different amounts of Clostridium cluster XIVa and cluster I, respectively . 2. There was no indication of an increase in the proportion of Clostridium cluster XIVa or cluster I during batch fermentation. Independent of the applied substrate, target gene copies ng-1 DNA were 106 for Bacteria and 105 for Archaea. In contrast, proportions of Clostridium cluster XIVa and cluster I were affected by the kind of substrate and its source (biogas plant). Gene copy numbers of Bacteria, Archaea and Clostridium cluster XIVa and cluster I of the batch experiment were reflected by those of the biogas plant. 3. Sequences obtained in preparation of high-throughput amplicon sequencing did not indicate the presence of C. botulinum. Introduction: Biogas is produced in reactors under anaerobic conditions by a consortium of microorganisms which commonly include bacteria of the genus Clostridium. Since the genus Clostridium also harbors some highly pathogenic members in its phylogenetic cluster I, e.g., Clostridium botulinum, there has been some concern that an unintended growth of such pathogens might occur during the fermentation process. A previous study revealed a selective effect of specific substrates used for biogas production on the bacterial and the clostridial community structures. However, the knowledge on the dynamics and on the presence of bacteria with lower abundance, particularly Clostridia is still very limited.
Das Projekt "Entwicklung eines In-vitro-Testprinzips für die Aktivitätsbestimmung von Botulinumtoxinen zum Ersatz von Tierversuchen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Paul-Ehrlich-Institut, Bundesinstitut für Impfstoffe und biomedizinische Arzneimittel, Abteilung Veterinärmedizin durchgeführt. Die gesetzlich vorgeschriebene Wirksamkeitsbestimmung der als Arzneimittel und Kosmetika hergestellten Botulinum-Neurotoxine BoNT/A und BoNT/B mittels LD50-Test erfordert jährlich über 600.000 Mäuse. Dieser qualvolle Tierversuch soll ersetzt werden. Wir wollen Assays entwickeln, die den Wirkmechanismus der Toxine (Bindung an Neuronen - Translokation in die Zelle - Spaltung neuronaler Proteine) in vitro abbilden. Botulinum-Neurotoxine wirken nach demselben Prinzip wie das Tetanus-Neurotoxin (TeNT). Wir haben bereits eine In-Vitro-Methode zur Bestimmung von TeNT entwickelt, die aktives Toxin anhand seiner Bindungsfähigkeit und Proteaseaktivität nachweist. Diese Strategie soll nun auf BoNT/A und BoNT/B übertragen werden und als Alternativtest dienen. Hierzu müssen zunächst die in dem Test verwendeten Bindungs- und Substratmoleküle an die Rezeptor- und Proteasespezifitäten der jeweiligen Botulinumtoxine angepasst und die Testbedingungen für jedes Toxin umfassend optimiert werden. Danach soll die Transferierbarkeit der Methode in andere Labore geprüft und ein Vergleich mit dem Tierversuch durchgeführt werden. Schließlich soll zur Validierung der Methode ein europäischer Ringversuch initiiert werden. Nach der Validierung wird eine Aufnahme der Methode in das Europäische Arzneibuch angestrebt, um eine breite Anwendung anstelle der LD50-Tests zu erreichen. Zudem soll geprüft werden, ob sich die Methode auch für weitergehende Anwendungen (z.B. Prüfung von Botulismusimpfstoffen) eignet.
Das Projekt "Entwicklung eines BoNT Wirksamkeits-Assays an humanen synaptischen Netzwerken als Alternativmethode zum LD50 Maus Test mittels iPSC-Technologie" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Düsseldorf, Institut für Neuro- und Sinnesphysiologie durchgeführt. Durch Reprogrammierung erzeugte humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) eröffnen neue Möglichkeiten der Entwicklung und Anwendung von in vitro differenzierten Zellkultursystemen. In diesem Projekt wird eine auf der iPSC-Technologie basierende Alternativ-Methode zum LD50-Maustest für die vorgeschriebene Wirksamkeitsprüfung von Botulinumneurotoxin (BoNT) Präparaten entwickelt. In vitro differenzierte menschliche Nervenzellen bilden die Grundlage für einen hochsensitiven und zuverlässigen Assay, der ein möglichst vollständiges replacement des LD50-Maustests ermöglichen soll. Die Kultivierung von aus humanen iPSC differenzierten Neuronen auf multi-electrode-arrays (MEAs) ermöglicht eine kontinuierliche elektrophysiologische Registrierung spontaner synaptischer Netzwerkaktivität. Nach einer pharmakologischen Charakterisierung wird durch Reduktion der extrazellulären Ca2+ Konzentration eine zur BoNT Wirkung vergleichbare Inhibition der synaptischen Funktion erzeugt, um die Sensitivität des Zellsystems zu testen. Mit diesem System werden dann die experimentellen Bedingungen für BoNT Dosis-Wirkungs-Kurven an funktionellen menschlichen Synapsen ermittelt. In einem zweiten Schritt werden die Ergebnisse aus dem MEA System auf ein Ca2+-Imaging-System mit wesentlich einfacherer Datenanalyse übertragen. Mit der Erstellung von BoNT Dosis-Wirkungs-Kurven mittels Ca2+-Imaging wird dann ein neues Alternativ-Verfahren zur Prüfung der BoNT Potenz in einem humanen System etabliert.
Das Projekt "Herstellung von keramischen Filtern zur photokatalytischen Entkeimung von Abwässern mittels Elektrospinning" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Hochschule Hannover, Fakultät II Maschinenbau und Bioverfahrenstechnik durchgeführt. Das Vorhaben zielt auf die Herstellung eines Trägersubstrats für TiO2 - Partikel ab, die zur intensiven Entkeimung von Ab- und Brauchwässern mit Hilfe von UV-Strahlung genutzt werden. Das Substrat soll: - Keramischer Natur sein, da Träger auf Polymerbasis durch hohe Leistungsdichte der UV-Strahlungsquellen zerstört, die TiO2 - Partikel ausgeschwemmt werden und die Entkeimungszelle an Funktion verliert. - Eine hohe Oberfläche besitzen, damit die Kontaktfläche von Ab- oder Brauchwasser mit dem Trägersubstrat entsprechend hoch ist. - Zur Erzielung einer möglichst hohen Betriebssicherheit die Möglichkeit zur thermischen Reinigung von organischem Material bieten. - Für eine ozonfreie Entkeimung geeignet sein. Das Substrat soll in Form einer Entkeimungszelle Abwasser bis auf Trinkwasserqualität entkeimen, Brauchwasser von Biogasanlagen von Bakterien befreien (speziell vom anaerob lebenden Bakterium Clostridium Botulinum) oder Bohrschlämme entkeimen.
Das Projekt "Clostridium botulinum und Clostridium difficile - Statuserhebungen der beiden Errerger entlang der Lebensmittelkette ('from stable to table')" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Bayerisches Staatsministerium für Umwelt und Gesundheit durchgeführt. Klärung ob und ggf. wie eine Übertragung der Erreger auf den Menschen möglich ist. Umfassende Statuserhebung mit dem Ziel eine fundierte, Beurteilung von Befunden bei lebensmittelliefernden Tieren sowie in den entsprechenden Lebensmitteln zu ermöglichen. Umfassende Risikobewertung für ausgewählte Stoff-Erreger-Kombinationen
Das Projekt "Entwicklung eines Real-Time-Reverse-Transcriptase-PCR-Verfahrens zum Nachweis von Clostridium-botulinum-(Typ A, B, E und F)-Neurotoxin-Produktion in Lebensmitteln als Alternative zum Mäuse-Bioassay" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Gießen, Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Professur für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde durchgeführt. Projektziel war es, eine Ersatzmethode des bislang als 'golden standard' geltenden Mäuse-Bioassays ('Mäusetest') zum Nachweis von Clostridium botulinum-Neurotoxinen (Bont) in Lebensmitteln durch ein Real Time Reverse Transkriptase - PCR - Verfahren (Real Time RT - PCR) zu entwickeln. Clostridium botulinum (C. botulinum) ist ein obligat anaerobes, sporenbildendes Stäbchenbakterium, das zur Familie der Clostridiaceae gehört. Der weit verbreitete Erreger ist in der Lage, sieben verschiedene Neurotoxintypen (Bont/A-G) zu produzieren. Botulinumtoxine gelten als stärkste natürlich vorkommende Gifte, die beim Menschen und bei Tieren den Botulismus verursachen. Bei Lebensmittelvergiftungen stehen hauptsächlich die Typen A, B und E, seltener F, im Vordergrund, während bei den Tieren überwiegend die Typen C und D klinisch Botulismus hervorrufen können. Der klassische Nahrungsmittel-Botulismus ist eine lebensbedrohliche Intoxikation des Menschen. Nach einer Inkubationszeit von wenigen Stunden bis mehreren Tagen treten schwerwiegende Krankheitssymptome auf, die den Tod nach sich ziehen können. Die Untersuchung einer verdächtigen Lebensmittelprobe bedarf gemäß der DIN-Norm 10102/§ 64 LFGB, L 06.00-26 einer Anzahl von mindestens 54 Versuchsmäusen. Deshalb wurde als Alternativmethode ein Real Time Reverse Transkriptase-PCR-Verfahren (Real Time RT -PCR) zum Nachweis von C. botulinum Typ A-, B-, E- und F-Neurotoxinproduktion in Lebensmitteln entwickelt. Ein solches molekularbasiertes Verfahren dürfte gleichzeitig als Basis für die innovative Entwicklung von weiteren Ergänzungs- und Ersatzmethoden dienen. Es ist gelungen, ein molekularbasiertes Verfahren (Real Time RT-PCR-Verfahren) zu entwickeln, mit dessen Hilfe ein eindeutiger, sowohl qualitativer als auch quantitativer Nachweis einer Genexpression aller Lebensmittel-assoziierten C. botulinum Toxintypen (Typ A, B, E und F), einschließlich deren Subtypen, möglich ist. Als Ausgangsbasis zur Etablierung der neuartigen Methode dienten 67, mittels biochemischer, serologischer und molekularbiologischer Feindifferenzierungs- und Typisierungsverfahren als C. botulinum charakterisierte Stämme (24 Typ A-, 31 Typ B-, sechs Typ E- und sechs Typ F-Stämme). Durch die Etablierung entsprechender Primer-Sondensysteme konnte über dem Nachweis der mRNA und deren Transkription in die cDNA eine Bont A-, B-, E- und F-Produktion nachgewiesen werden. Die absolute Quantifizierung basierte auf einer dekadischen Verdünnungsreihe von Bont A-, B-, E- und F-cDNA und wurde anhand einer Standardkurve berechnet. Die relative Quantifizierung der Bont A, B, E und F erfolgte durch den Einsatz eines als endogene Kontrolle fungierenden 'Housekeeping'-Gens, unter Einbeziehung der vergleichenden Ct-Methode. Auf dieser Weise konnte die tatsächliche Expression und somit die reale Menge an produziertem Neurotoxin ermittelt werden. Insgesamt kann eine Methodenkaskade vorgestellt werden, die als Alternative zum Mäuse-Bioassay dienen kann.
Das Projekt "Überleben von Clostridium botulinum auf landwirtschaftlichen Nutzflächen - Anschlussprojekt zur Risikoabschätzung bei der Entsorgungskette von biologischen Materialien im Hinblick auf toxinbildende Mikroorganismen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Göttingen, Institut für angewandte Biotechnologie der Tropen durchgeführt. A) Problemstellung: Clostridium botulinum ist ein weltweit verbreitetes Boden- und Sedimentbakterium, das unter geeigneten Bedingungen ein Toxin produzieren kann, das bei Mensch und Tier zu Botulismus - einer schweren Lebensmittelvergiftung mit oft tödlichem Ausgang - führen kann. Durch Untersuchungen von Prof. Böhnel, Universität Göttingen, wurde nachgewiesen, dass Kompost Clostridium botulinum enthalten kann. Daraufhin wurde vom UBA ein UFOPLAN-Vorhaben mit zwei Teilprojekten initiiert. Im ersten Teilprojekt wurde untersucht, ob es auf dem Weg zum Verbraucher (z.B. Blumenerde) zu Toxinbildung kommen kann. Das Vorhaben wurde 2000 abgeschlossen mit dem Ergebnis, dass eine aktuelle Gefährdung der Verbraucher durch Toxinproduktion nicht gegeben ist. Im zweiten Teilprojekt (FKZ 20062201) wurde untersucht, wie mit Kompost ausgebrachte Clostridium botulinum Bakterien auf einer landschaftlichen Nutzfläche überleben. Es zeigte sich, dass sie Überlebensfähigkeit von Clostridium botulinum erstaunlich groß war. Auch nach Ende des Forschungsprojektes waren noch hohe Bakterienkonzentrationen im Boden nachweisbar. Für eine Risikoabschätzung ist es sehr wichtig, das Überleben von Clostridium botulinum in diesem Boden weiter zu verfolgen. B) Durchführung: Die bereits im vorausgegangenen Projekt mit Clostridium botulinum haltigen Kompost angeimpften Versuchsflächen werden weiter aus das Überleben dieser Bakterien untersucht. C) Ziel des Vorhabens ist eine Risikoabschätzung beim Ausbringen von biologischen Materialien, die Clostridium botulinium enthalten können, auf landwirtschaftliche Nutzflächen.
Das Projekt "Naturraumpotential Neusiedler See - Seewinkel - Vorkommen, Toxinproduktion von Clostridium botulinum im Biotop, in Kadavern und Nahrungsorganismen (Invertebraten); Wasserchemie, Entwicklung der Invertebratenfauna; Giftaufnahme durch Wasservoegel" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Arbeitsgemeinschaft Gesamtkonzept Neusiedler See durchgeführt. Problemstellung und Zielsetzung: Erfassung der Nahrung, mit der das Gift von den Wasservoegeln aufgenommen wird; oekologische Voraussetzungen fuer die Vermehrung und Toxinproduktion von Clostridium botulinum. Methodischer Ansatz: 1. Nachweis von Clostridium botulinum im Biotop, in Kadavern und Nahrungsorganismen. 2. Chemische Wasseruntersuchungen, vor allem Stickstoff und Phosphor, Populationsuntersuchungen und quantitative Toxinnachweise bei Nahrungsorganismen (Fliegenlarven und -imagines), Plankton, Schlammfauna. 3. Quantitative Toxinnachweise im Verdauungstrakt der Wasservoegel, Nahrungsoekologie betroffener Vogelarten an den Lacken. Anwendungsgebiet: Seewinkellacken sind Rastplaetze von internationaler Bedeutung fuer Wasservoegel, Funktion durch Botulismus eingeschraenkt.
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