Das Projekt "Teilprojekt 4" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von BASF SE durchgeführt. Das Ziel des Projektes ist es, den COMET Assay zum Nachweis gentoxischer Schäden in 3D Hautmodellen zu etablieren und die Robustheit dieser Methode zu prüfen. Dies geht einher mit der Untersuchung möglicher DNA- Reparaturmechanismen in den 3D- Hautmodellen. Im Anschluss an das Hautmetabolismusprojekt, soll die metabolische Kompetenz der 3D Modelle weiter komplettiert werden. In Teilaufgabe 1 werden 20 bekannte Testsubstanzen von drei verschiedenen Laboreinheiten mittels COMET Assays an zwei Vollhautmodellen getestet. Die Durchführung erfolgt in drei Phasen. Nach jeder Phase werden die erzielten Ergebnisse verglichen und bei guter Übereinstimmung die nächste Prüfphase eingeleitet. In Teilaufgabe 2 soll die metabolische Kompetenz der Hautmodelle weiter ausgeführt werden. In Teilaufgabe 3 wird die DNA-Reparaturkapazität der Hautmodelle untersucht.
Das Projekt "Teilprojekt D" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Technische Universität Darmstadt, Radiation Biology and DNA Repair, AG Löbrich durchgeführt. Das Gesamtziel des Vorhabens liegt in der Erforschung des Zusammenhangs zwischen einer genetischen Prädisposition und der Entstehung von Krebs im Kindesalter. Schwerpunkt von AP5 und AP6 ist es, zelluläre Untersuchungen mit molekularen Analysen zu komplementieren, um einen tieferen Einblick in die einer Tumorentstehung zugrunde liegenden molekulargenetischen Ursachen zu erlangen. Dabei wird untersucht, inwieweit sich Checkpoint- und Reparaturkapazität genetisch im Hinblick auf die Krebsentstehung vorbelasteter Personen von gesunden Personen unterscheidet. Genomische Analysen sollen Einblick in mögliche Ursachen der Krebsentstehung liefern. Die Arbeitsschritte (Rekrutierung der Probanden, Etablierung der Zelllinien, molekulare/zelluläre Untersuchungen) werden von verschiedenen Arbeitsgruppen durchgeführt, die eng verzahnt arbeiten. Schließlich sollen die Daten der verschiedenen Endpunkte korreliert und gemeinsam veröffentlicht werden. AP5: Im Rahmen des ISIMEP-Projekts wurden Zelllinien aus Biopsien von Patienten mit Zweittumor nach Ersttumor im Kindesalter und Zelllinien aus Biopsien von Patienten mit Ersttumor im Kindesalter ohne Zweittumor auf ihre Checkpoint- und Reparaturkapazität untersucht. Diese Untersuchungen werden nun an 20 neu etablierten, gematchten Kontrollzelllinien durchgeführt. Von allen 60 Zelllinien sollen molekulargenetsiche Analysen durchgeführt und evtl. vorliegende genomische Auffälligkeiten in Genen der DNA-Reparatur oder Zellzykluskontrolle mit dem zellulären Verhalten korreliert werden. Auffällige Zelllinien werden schließlich eingehenden Reparatur- und Zellzyklusstudien unterzogen. AP6: Die im Rahmen von AP2 rekrutierten ca. 300 Zelllinien aller drei Patientengruppen werden mit den bereits etablierten Screening-Verfahren auf ihr Zellzyklus- und Reparatur-Verhalten nach hohen und nach niedrigen Dosen untersucht. Die Daten werden statistisch ausgewertet und mit den epidemiologischen und genomischen Daten korreliert.
Das Projekt "Teilprojekt B" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universitätsklinikum Essen (AöR), Institut für Medizinische Strahlenbiologie durchgeführt. Ziel des vorliegenden Projektes ist es den Einfluss der Chromatinstruktur auf die Funktion des B-NHEJ zu untersuchen und zu testen inwiefern die starke Einschränkung dieses Reparaturweges, die in G0 Zellen beobachtet wird, auf die Kondensierung des Chromatins zurückzuführen ist. Folgende Aspekte werden untersucht: Die Kondensierung des Chromatins in G0 Zellen durch DAPI Färbung in Kombination mit quant. Bildanalyse. Der Einfluss von Änderungen der Chromatinstruktur durch hypotonische Behandlung auf den B-NHEJ in G0-Zellen. Die Zusammenhänge zwischen Änderung der DNA Methylierung und Chromatin Kondensierung. Dafür wird die Behandlung mit 5-Aza-C durch DAPI Färbung und Messung der B-NHEJ Aktivität optimiert. Unter optimierten Bedingungen wird die DNA Methylierung mittels Elisa bestimmt, durch Sequenzierung von Bisulfit modifizierter DNA in Gruppen von 3-6 CpGs verifiziert und der Methylierungsstatus der DNA in Promotorbereichen quant. durch Methylierungsprofil-Chips erfasst. Der Methylierungsstatus von G0 und G1 Zellen wird untereinander und mit Parametern, die die B-NHEJ Aktivität beeinflussen verglichen. Der Einfluss von miRNAs der DNMT1 auf die Aktivität von B-NHEJ wird erfasst. Die Auswirkungen von Proteinen der HP1 Familie wird durch Überexpression und Suppression mittels RNA-Interferenz auf die B-NHEJ Aktivität bestimmt. Da Zellen mit Defekten in DNA-PKcs keine Hemmung von B-NHEJ in G0 zeigen, sollen die Wechselwirkungen von DNA-PK auf die Chromatinstruktur analysiert werden.
Das Projekt "Teilprojekt 1" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Bundesinstitut für Risikobewertung durchgeführt. Das Hauptziel des Projektes besteht in der Prävalidierung des Comet-Assays in den beiden geeigneten Vollhautmodellen, für die in der ersten Förderphase eine ausreichende metabolische Kompetenz nachgewiesen wurde. Weiterhin soll die Charakterisierung der Vollhautmodelle anhand der Testsubstanz Cumarin vervollständigt und durch Untersuchungen zur DNA-Reparaturkapazität ergänzt werden. Zunächst wird die Datenbasis zur metabolischen Kompetenz der beiden geeigneten Vollhautmodelle(MatTek EpidermFT und PhenionFT) erweitert. Dazu soll Cumarin als weitere Modellsubstanz untersucht werden. Quantitative Bestimmungen sind für die Metabolite 3-Hydroxycumarin, 7-Hydroxycumarin, sowie die Hydrolyseprodukte des Cumarin-3,4-epoxids vorgesehen. Die Prävalidierung des Comet-Assays erfolgt parallel in beiden Vollhautmodellen. Das BfR wird im Rahmen dieser Studie insgesamt 24 Substanzen testen. Zur vergleichenden Untersuchung von DNA-Reparaturmechanismen wird das karzinogene anti-Benzo(a)pyren-7,8-diol-9,10-epoxid (BPDE) als Modellsubstanz verwendet, das als nukleophiles Mutagen mit DNA reagiert und bevorzugt Guanosyl- oder Adenosyl-Addukte bildet. Für deren Quantifizierung wird eine LC-MS/MS-basierte Methode entwickelt. Das BfR beteiligt sich auch an der Charakterisierung von Enzymen, die bei der Reparatur oder Vermeidung von oxidativen DNA-Schäden in der Haut und in Hautmodellen von Bedeutung sind. Die wirtschaftliche Bedeutung des Projektes liegt im Potential zur Einsparung von hohen Kosten bei Tierversuchen, insbesondere bei Genotoxizitätsstudien. Die gesellschaftliche Bedeutung liegt in seinem Beitrag zur Umsetzung des ethischen Grundkonsensus, auf Tierversuche möglichst zu verzichten. Ein wissenschaftlich-wirtschaftlicher Erfolg des Projektes ist aufgrund des dringend zu deckenden Bedarfs an validen und prädiktiven Testverfahren sehr wahrscheinlich. Die beteiligten Partner verfügen über langjährige Erfahrungen und Expertisen auf dem hier adressierten Forschungsgebiet.
Das Projekt "Teilprojekt 3" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Uniklinik RWTH Aachen, Klinik für Dermatologie und Allergologie durchgeführt. Das Ziel des beantragten Projektes besteht in der Prävalidierung des Comet-Assays in den metabolisch kompetenten Vollhautmodellen von MatTek und Henkel. Ferner soll in den Hautmodellen und in humaner Vollhaut die DNA-Reparaturkapazität anhand von Testsubstanzen untersucht werden, die in den Zellen DNA-Addukte bilden oder oxidative Schädigungen verursachen. In verschiedenen Teilaufgaben wird die metabolische Charakterisierung der Hautmodelle vorgenommen. Als Schwerpunkte werden die Metabolitenmuster von drei weiteren Testsubstanzen sowie Aktivitäten und Expressionsmuster bisher nicht untersuchter Enzymfamilien in den Hautmodellen bestimmt und mit der menschlichen Vollhaut verglichen. Weiterhin wird die Prävalidierung des Comet-Assays in den ausgewählten Hautmodellen durchgeführt und die Reparaturkompetenz in den ausgewählten Hautmodellen und humaner Vollhaut soll vergleichend analysiert werden.
Das Projekt "Teilprojekt A" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von GSI Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung GmbH durchgeführt. Das Hauptziel des Vorhabens ist die Aufklärung der grundlegenden Mechanismen der frühen Prozessierung heterochromatischer DNA Schäden, um so die zellulären Auswirkungen einer fehlerhaften Reparatur im HC besser abschätzen zu können. Im Besonderen soll die Rolle der nach Ionenbestrahlung in Heterochromatin gefundenen lokalen Dekondensation und Relokalisation der Schäden in der Reparatur untersucht werden. Verschiedene Schwerpunkte des Einflusses der Schadenskomplexität auf die Prozessierung von DNA DSBs im Kontext der Kernarchitektur werden im Verbund von einem HGF Laboratorium und zwei universitären Partnern bearbeitet. Die räumliche und zeitliche Koordination von Reparaturfaktoren an DNA Schäden nach Röntgen - bzw. dicht ionisierenden Teilchenstrahlen wird an den Strahlplätzen der GSI mit innovativsten Bestrahlungstechnologien und hochauflösender Lebendzell-Mikroskopie untersucht. Parallel verlaufende molekularbiologische Arbeiten erlauben einen Einblick und auch einen Eingriff in die molekularen Abläufe der frühen Prozessierung. Neue Fluoreszenztechniken wie z.B. FLIM (fluorescence lifetime imaging) werden am Strahlplatz etabliert um dynamische Prozesse der lokalen Schadensantwort im Kontext der Chromatinstruktur zu messen.
Das Projekt "Teilprojekt 2" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Freie Universität Berlin, Institut für Pharmazie, Arbeitsgruppe Pharmakologie und Toxikologie durchgeführt. Ziel des Projektes ist die weiterführende Charakterisierung der im vorausgehenden Verbundprojekt identifizierten metabolisch kompetenten Hautmodelle im Vergleich zu Humanhaut. Insbesondere sollen die Studien die Datenlage zur Biotransformation vervollständigen. Die systematische Erweiterung der Erkenntnisse zur metabolischen Kompetenz der beiden geeigneten Hautmodelle ermöglicht die Prävalidierung des Comet-Assays als genotoxische Testmethode in diesen Testsystemen. Darüber hinaus werden im Verbundprojekt Transporterproteine, Enzyminduktion sowie DNA-Reparaturmechanismen näher untersucht. Von der FU Berlin wird in zwei Vollhautmodellen und Humanhaut zentral die Biotransformation der genotoxischen Industriechemikalie 2,4-Diaminotoluol untersucht, welche zu den prioritären Substanzen gehört, die im Comet-Assay positiv reagieren. Als zweiter Schwerpunkt werden parallel weitere, für die Metabolisierung relevante Enzyme und deren Aktivitäten vergleichend zu exzidierter Humanhaut charakterisiert. Die Bestimmung wichtiger Phase II Enzyme umfasst Glutathion-S-Transferasen, Sulfotransferasen, Steroid-5alpha-Reduktasen sowie Monoaminoxidasen.
Das Projekt "Experimentelle Untersuchung zur Frage einer Co-kanzerogenen Wirkung von Arsen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Hamburg, Ordinariat für Arbeitsmedizin, Arbeitsgruppe Toxikogenetik durchgeführt. Das Projekt geht davon aus, dass die kanzerogene Wirkung von Arsen gesichert ist, und dass diese Wirkung offenbar nicht ueber einen direkt genotoxischen Mechanismus erklaert werden kann. In der Literatur wurde von einigen Autoren eine Hemmung von den Reparaturmechanismen als Erklaerung fuer die kanzerogene Wirkung postuliert, ohne dass dafuer bisher experimentelle Beweise vorgelegt werden konnten. Eigene Voruntersuchungen zur Beeinflussung des DNA-Reparaturenzyms O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase (AT) durch Arsen und andere Schwermetalle wie z.B. Cadmium, Nickel, Blei und Quecksilber hatte ergeben, dass dieses Reparaturenzym durch die genannten Schwermetalle in Zellkulturen nicht direkt gehemmt wird. Inkubiert man jedoch die Zellen mit Arsen in Gegenwart eines methylierenden Agenz, z.B. MNNG, kommt es zu einem fast voelligen Verlust der Reparaturkapazitaet, der nicht beobachtet wurde, wenn die Zellen nur mit einem der beiden Stoffe allein belastet wurden. Aus diesen Befunden hatten wir geschlossen, dass es durch Arsen (und moeglicherweise auch durch andere Schwermetalle mit kanzerogener Potenz, wie beispielsweise Cadmium) zu einer Wirkungsverstaerkung DNA-alkylierender Agenzien kommt, die dadurch zu erklaeren ist, dass ein spezifischer Reparaturmechanismus, naemlich die O6-Alkyguanin-DNA-Alkyltransferase, in exponierten Zellen beeintraechtigt wird. Folgende Fragen sollten geklaert werden: - Ist die co-kanzerogene Wirkung von Arsen spezifisch fuer DNA-methylierende Agenzien? - Kann die Reparaturhemmung, die ja offenbar nicht ueber eine direkte Hemmung der enzymatischen Aktivitaet der O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase laeuft, ueber eine Blockung der
Das Projekt "Die Funktion von zellulären Pathways im Verlauf des Auftretens einer genetischen Instabilität von bestrahltem Gewebe" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Helmholtz Zentrum München, Institut für Strahlenbiologie durchgeführt. Die Funktion von zellulären Pathways, die die DNA-Reparatur und DNA-Stabilität regulieren, wird im Verlauf des Auftretens einer genetischen Instabilität von bestrahltem Gewebe untersucht. Speziell werden wir uns auf die Retinoblastom- und Brca1/FancA Signalwege konzentrieren. Diese experimentellen Untersuchungen werden komplementiert durch epidemiologische Studien an Strahlen-assoziierten Mammatumoren aus einer schwedischen Kohorte sekundärer Krebsfälle nach Strahlentherapie und aus einem Kollektiv weiblicher Tschernobyl-Liquidatoren. Mathematische Modelle sollen entwickelt werden, um aus dem dabei gewonnen Daten Vorhersagen zur Rolle einer induzierten genomischen Instabilität bei der Strahlen-karzinogenere zu treffen.
Das Projekt "Untersuchungen zum Nachweis von genotoxischen Umweltschadstoffen mit der Einzelzell-Gelelektrophorese an menschlichen Zellen (Fortsetzung)" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Ulm, Abteilung Klinische Genetik durchgeführt. Die Einzelzellgelelektrophorese (SCG) Technik ist der zur Zeit empfindlichste Kurzzeittest zum Nachweis gentoxischer Substanzen in einzelnen Zellen. Eine wichtige zukuenftige Anwendung ist im Human Biomonitoring zu sehen und in der Untersuchung von Tieren (zB Fische, Wuermer) zum Nachweis einer gentoxischen Umweltbelastung. Das hier geplante Projekt soll zur Validierung der Methode beitragen und mit experimentellen Ansaetzen Aussagen zu den Einsatzmoeglichkeiten im Biomonitoring machen. Dazu werden menschliche Zellen in vitro mit verschiedenen Schadstoffen behandelt. Es wird untersucht, wie lange induzierte DNA-Schaeden in proliferierenden und nichtproliferierenden Zellen nachgewiesen werden koennen. Mit Hilfe von reparardefekten Zellen wird der Einfluss der DNA-Reparatur auf die Persistenz induzierter DNA-Schaeden untersucht. Ausserdem werden nicht-gentoxische Kanzerogene untersucht, um zu klaeren, ob die im SCG-Test beobachteten Effekte spezifisch fuer gentoxische Wirkungen sind oder auch als Folge zytotoxischer Wirkungen (Zelltod) auftreten koennen. Ergebnisse: Es wurden Untersuchungen mit der Einzelzellgelelektrophorese (SCG-Test oder Comet Assay) durchgefuehrt, um Aufschluesse ueber einen Einsatz dieser Methode im Rahmen von Biomonitoring-Studien zu erhalten. Fruehere Untersuchungen hatten gezeigt, dass der SCG-Test eine sehr sensitive Methode zum Nachweis eines breiten Spektrums von DNA-Schaeden in vivo und in vitro ist. Im Rahmen dieses Projektes konnte zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass starke koerperliche Belastung zu DNA-Veraenderungen fuehrt, die mit dem SCG-Test erfasst werden koennen. Ein Mehrstufentest auf dem Laufband fuehrte zu einer deutlichen Zunahme von DNA-Strangbruechen in Leukozyten. Dieser Effekt trat mit zeitlicher Verzoegerung auf und betraf die Mehrzahl der untersuchten Zellen. Da eine Zunahme von DNA-Schaeden nur nach starker koerperlicher Belastung unter anaeroben Stoffwechselbedingungen auftrat, wurde oxidativer Stress als Ursache vermutet. Tatsaechlich konnten die Autoren zeigen, dass die Einnahme von Vitamin E vor dem Lauf den DNA-schaedigenden Effekt verhindert. Diese Ergebnisse geben einen wichtigen Hinweis auf die Bedeutung freier Radikale als Ursache der DNA-Schaedigung nach koerperlicher Belastung. In einer ersten Populationsstudie mit dem SCG-Test konnte nachgewiesen werden, dass Muelldeponiearbeiter gegenueber einem Kontrollkollektiv vermehrt DNA-Effekte im SCG-Test aufweisen. Der Mittelwert der DNA-Schaedigung zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Dieser Unterschied war deutlicher, wenn das 'tail-moment' anstelle der Gesamtlaenge der DNA-Migration ('image-length') fuer die Auswertung zugrunde gelegt wurde...
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