Das Projekt "Teilprojekt A" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Fraunhofer-Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin (ITEM) durchgeführt. ExITox-2 hat zum Ziel eine integrierte Teststrategie (IATA) zu entwickeln, die Tierversuche mit wiederholter inhalativer Verabreichung ersetzt. Das in ExITox-1 entwickelte Read Across (RAX) Konzept wird weiterentwickelt. Neben der Gruppe der Vinylester, werden vier neue Gruppen, die Lungenfibrose bzw. Entzündung verursachen, getestet. Neue Aspekte sind: Integration von in vitro Daten aus Toxv21; Abschätzung der Toxikokinetik mit Hilfe von PBPK- und QSAR Modellen; Unterscheidung von Genexpressionsveränderungen bei geringen und hohen Dosen; Analyse der microRNA; Bestätigung der Geneveränderungen durch RTqPCR. Mastersignalwege werden entwickelt und zellspezifische Antworten von Stressantworten unterschieden. Das Projekt gliedert sich in 6 Arbeitspakete (AP), zu denen ITEM wie folgt beiträgt: Die RAX Gruppen werden anhand der Lungeneffekte mit Hilfe der RepDose Datenbank ausgewählt. Chemische Ähnlichkeit, Daten aus Toxv21 und der PASS Software werden berücksichtigt (AP1). Die Absorption nach Inhalation wird mittels eines PBPK Models abgeschätzt. QSAR Modelle und experimentelle Daten werden soweit möglich berücksichtigt (AP2). Der apparenten Permeabilitätskoeffizient wird für die Leitstoffe der RAX-Gruppen bestimmt. Weiter werden A549 Zellen (AP3) und vitale Lungenschnitte (AP4) submerse oder luftgetragen wiederholt exponiert, um dosisabhängig Zytotoxizität zu testen, RNA zu isolieren und Expression der microRNA zu untersuchen. mRNA wird für genomweite Analysen zur Verfügung gestellt. Biomarker werden durch RTqPCR bestätigt (AP3). Die Ausschüttung relevanter Zytokine wird gemessen (AP4). Die experimentellen und modellierten Daten werden durch einen Vergleich mit den vorliegenden in vivo Daten in eine IATA integriert. Die Biomarkerinduktion wird untersucht, Hochdosiseffekte werden von ersten Veränderungen bei geringen Dosen unterschieden. Die biologischen Profile innerhalb und unter den RAX-Gruppen werden verglichen, Grenzen und Unsicherheiten der IATA dargestellt (AP6).
Das Projekt "Teilprojekt A" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Fraunhofer-Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin (ITEM) durchgeführt. Ziel ist die Entwicklung einer integrierten Teststrategie (ITS) zur Bewertung des menschlichen Gesundheitsrisikos durch Toxizität bei wiederholter inhalativer Exposition. Die ITS wird routenspezifische Biomarker und Ergebnisse von Datenrecherchen und QSAR-Vorhersagen beinhalten. Strukturverwandte Chemikalien werden zusätzlich getestet, um zu prüfen, ob das System Read-Across zulässt. Drei Modellsubstanzen werden ausgewählt, deren In-vivo-Daten (zum Transkriptom und Studien zur wiederholten Verabreichung) unterschiedliche Wirkungsweisen vermuten lassen. Untersucht werden das toxikologische Profil (besonders Zielorgane und Effekte) und die Metabolite dieser Modellsubstanzen. Je Modellsubstanz werden zwei 'ähnliche' Substanzen ausgewählt. Durch ex-vivo-Tests in Lungengewebe (Precision-cut lung slices, PCLS) sollen die Zytotoxizität (z.B. LDH- oder Wst-1-Assay) und pro-inflammatorische Zytokine untersucht sowie genomweite Transkriptomanalysen durchgeführt werden. In Folge wird eine geeignete humane Lungenzellinie für In-vitro-Tests ausgewählt, daran Zytotoxizitätstests zur Dosisfindung und ebenfalls Transkriptomanalysen durchgeführt. Entsprechend der dadurch identifizierten Wirkmechanismen werden anschließend ausgewählte funktionelle Assays zur Validierung durchgeführt (z.B. Entzündung, oxidativer Stress, Transkriptionsfaktoren). Die Erkenntnisse sollen in eine ITS integriert und die Prädiktivität der Biomarker im Hinblick auf regulatorische Entscheidungen evaluiert werden.
Das Projekt "Zum Mechanismus der immunsuppressiven Wirkung des TCDDs und bestimmter PCDD- und PCDF-Kongenere" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Düsseldorf, Medizinisches Institut für Umwelthygiene durchgeführt. In subchronischen Studien an Maeusen soll mit empfindlichen Parametern das immuntoxische Potential von TCDD und relevanten Kongeneren aus der PCDD/PCDF-Reihe eingeschaetzt werden. Zur Untersuchung der Effekte sehr niedriger TCDD-Dosierungen erhielten die Tiere zunaechst eine Initialdosis und anschliessend Erhaltungsdosen bis zum Ende des Versuchs. Einerseits wurde die Expression von Wachstumsfaktoren und Zytokinen in verschiedenen Organen gemessen, andererseits wurden die Thymozytenanzahl und Verteilung einzelner Subpopulationen untersucht. In der Leber blieben die Zytokine unveraendert, in der Lunge und im Thymus konnte jedoch eine signifikante Erhoehung von Interleukin-1-beta nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass Lunge und Thymus Gewebe mit sehr hoher Ah-Rezeptorkonzentration sind. Bei in-vivo Belastung von Maeusen mit niedrigen TCDD-Dosen waren die Thymozytenanzahl erniedrigt, und es wurden vermehrt CD8-positive Zellen generiert. Fuer sehr niedrige Dosen konnte dieser Befund jedoch nicht reproduziert werden.
Das Projekt "Individuelle Risikofaktoren fuer die UV-vermittelte Entstehung von Hautkrebs (Teil 1)" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Mainz, Hautklinik durchgeführt. Veraendertes Freizeitverhalten sowie die Ausduennung der Ozonschicht fuehren zu verstaerkter UV-Belastung und sind mit einem signifikanten Anstieg von Tumorerkrankungen der Haut assoziiert. Arbeiten aus dem eigenen Labor und anderer weisen darauf hin, dass UV-Licht die Immunabwehr der Haut gegenueber Tumoren u.a. durch Aktivierung von biologischen Signalvermittlern (Zytokinen) beeintraechtigen kann. Ziel dieses Projekts ist es daher, zu untersuchen, ob Hautzellen von Tumorpatienten im Vergleich zu Normalpersonen nach UV-Bestrahlung verstaerkt Zytokine bilden, die eine Einschraenkung der Tumorabwehr bewirken und somit ein erhoehtes Risiko fuer die Entwicklung von Hauttumoren erklaeren. Hierzu soll im Teilprojekt A (Hautklinik Mainz) mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion und der ELISA-Technik das Zytokinmuster verschiedener Hauttumore im Vergleich zu gesunder Normalhaut unter UV-Exposition ermittelt werden. Dies erfolgt in Zusammenarbeit mit der Beiersdorf AG (vgl. Teilprojekt B). Auf Grundlage dieser Untersuchungen soll ein Testsystem zur Abschaetzung des Risikos einer UV-bedingten Tumorentstehung bei Normalpersonen entwickelt werden.
Das Projekt "Der Thymus als Zielorgan von Ah-Rezeptor-bindenden immuntoxischen Fremdstoffen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Düsseldorf, Medizinisches Institut für Umwelthygiene durchgeführt. Die Wirkung von Dioxinen auf die Thymozytenentwicklung und -differenzierung laesst vermuten, dass Dioxine und andere Ah-Rezeptor-bindende Fremdstoffe in diesem Organ eine Modulation von Signalmolekuelen verursachen. Dazu gehoeren Zytokine und Adhaesionsmolekuele, die der Zellkomunikation zwischen epithelialen Zellen des Thymus und den Thymozyten selbst dienen. Daher soll die Ah-R-abhaengige Modulation von Zytokinen und Adhaesionsmolekuelen durch Tetrachlordibenzodioxin (TCDD) analysiert werden. Durch Untersuchung von Ah-R-defizienten Maeusen soll die physiologische Rolle des Ah-R fuer die Entwicklung und Differenzierung, besonders des Thymus und des T-Zellrepertoires, aufgeklaert werden. Ferner soll beantwortet werden, inwiefern der Ah-R die toxischen Effekte von Dioxinen und anderen Chemikalien bestimmt.
Das Projekt "Identifizierung der Faktoren, die fuer die Fibrosierung nach Quarzbelastung verantwortlich sind" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Düsseldorf, Medizinisches Institut für Umwelthygiene durchgeführt. Inzuchtstaemme der Maus wurden hinsichtlich der Fibrosebildung nach Quarzinjektion verglichen. Ein High- und ein Low-Responder-Stamm wurden identifiziert. In beiden Staemmen kam es zu einer gleich starken Zunahme des Gewichts des Popliteallymphknotens und der B- und T-Lymphozyten darin. Quarztypische Areale, die Fibroseherde darstellen, waren beim High-Responder stark ausgepraegt, beim Low-Responder nicht. Die Anfaerbung mit monoklonalen Antikoerpern gegen Aktivierungsmarker zeigte, dass die Makrophagen des High-Responders stark aktiviert waren, die des Low-Responders dagegen kaum. Auch nach inhalativer Quarzbelastung fanden sich beim High-Respnder starke fibrotische Veraenderungen beim Low-Responder dagegen nur geringe. Nach i.p. Quarzinjektion wurden die Peritonealzellen (sie enthalten viele Makrophagen) hinsichtlich der mRNA fibrogener Zytokine mittels PCR untersucht. Waehrend die Peritonealzellen des High-Responders viel mRNA von IL1, IL6 und TNF-alpha enthielten, war dies beim Low-Responder nicht der Fall. Die Ausbildung silikotischer Veraenderungen erwies sich als T-zellunabhaengig. Offensichtlich wirkt Quarz direkt auf Makrophagen. Waehrend die Makrophagen des High-Responders durch Quarz stimuliert werden und vermehrt fibrogene Zytokine bilden, ist dies beim Low-Responder nicht der Fall.
Das Projekt "Alternativmethoden: OpTest - Optimierte In-vitro-Testung von Fremdstoffen auf sensibilisierendes Potenzial durch CRISPR/Cas9-vermittelten Knockdown der inhibitorischen Moleküle PD-L1 und Arylhydrocarbon-(Ah)-Rezeptor in dendritischen Zellen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Charite Universitätsmedizin Berlin, Campus Benjamin Franklin, Institut für Klinische Pharmakologie und Toxikologie durchgeführt. In den letzten Jahren wurden verschiedene Zellkulturassays zur Untersuchung von Fremdstoffen auf ihr Potenzial entwickelt, Allergien nach Hautkontakt auszulösen. Diese Systeme bilden die Reifung dendritischer Zellen (DC) ab. Ein Problem aller Ansätze: Chemikalien können nur schwache Expressionsveränderungen von Reifungsmarkern auf DC in Kultur bewirken. Für eine starke Aktivierung mit einer gut messbaren Hochregulation von Aktivierungsmarkern ist nach neuesten Erkenntnissen eine Hemmung von sogenannten Inhibitionsmarkern notwendig. Von Interesse sind auch Forschungsergebnisse über den Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor (AhR). Der AhR wird von DC exprimiert und fungiert als Co-Inhibitor. Die o.g. Inihibitonsmarker sollen molekularbiologisch und mittels Antikörpern in der humanen DC-Linie MUTZ-3 ausgeschaltet oder blockiert werden, um die Hemmung der DC-Aktivierung zu durchbrechen. Die so behandelten MUTZ-3 werden in Kokultur mit Keratinozyten (HaCaT) eingesetzt. Als Kontaktallergene werden Modellsubstanzen verwendet, die in vivo und in vitro übereinstimmend als extrem, stark oder moderat sensibilisierend bzw. als negativ eingestuft wurden. In einer 2. Phase werden Kombinationen von spezifischem Knockdown mit Antikörperblockade untersucht, um Bedingungen zu identifizieren, bei denen die getesteten Kontaktallergene einen maximalen dynamischen Bereich in den Expressionswerten von Oberflächenmarkern und Zytokinen zeigen. In der dritten Phase werden die über Knockdown/Blockade inhibitorischer Moleküle behandelten MUTZ-3-Zellen mit naiven T-Zellen kokultiviert und überprüft, ob die T-Zellen sich teilen und spezifische Zytokine freisetzen.
Das Projekt "Einfluss von Luftschadstoffen auf die Induktion von Entzuendungsmediatoren in Keratinozyten - In vitro-Untersuchung zu hautirritations- und allergiefoerdernden Luftinhaltsstoffen" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Heidelberg, Universitäts-Hautklinik durchgeführt. Ziel der Studie, ist es festzustellen ich welchem Umfang Luftschadstoffe eine irriative und/oder allergisierende, d.h. entzuendungsinduzierende Potenz fuer die Haut haben. Dazu werden Keratinozyten in vitro mit Luftproben aus einem Ballungsgebiet und einem Reinluftgebiet Baden-Wuerttembergs exponiert. Die Luftproben wurden in verschiedenen Jahreszeiten und Belastungssituationen gesammelt. Als Parameter der Entzuendungsinduktion wird die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine (IL-1a, IL-6. IL-8 und GM-CSF) bestimmt und das erhaltene Aktivierungsmuster mit dem irritativer bzw. allergiesierender Mustersubstanzen verglichen. Es wird erwartet, dass die Studie Aufschluss darueber gibt, ab welchen Konzentrationen Luftschadstoffe irritierende und/oder allergisierende Veraenderungen bewirken.
Das Projekt "Untersuchungen verschiedener Makrophagenfunktionen nach Ozonexposition und Virusinfektion in vitro" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Fraunhofer-Institut für Toxikologie und Aerosolforschung durchgeführt. Ausgehend von vorangegangenen Untersuchungen (Projekt PUG L89003) ueber die Auswirkungen einer Kombination von Schadstoffexposition (Ozon) und Virusinfektion (RSV gleich 'respiratory syncytial virus') auf die pulmonalen Abwehrmechanismen, in denen Veraenderungen von Makrophagen-Funktionen insbesondere bei gleichzeitiger Belastung mit Ozon und Virusinfektion beobachtet wurden, war es die Aufgabe dieser Studie, in einem neuen in vitro Modell die durch bronchoalveolaere Lavage gewonnenen Alveolarmakrophagen (AM) von BALB/c-Maeusen vergleichbaren Belastungen auszusetzen. In der Untersuchung wurden proinflammatorische Cytokine (IL-1, IL-6 und TNF) und die mikrobiziden Eigenschaften der Makrophagen bestimmt. Ferner wurde der Einfluss der Ozonexposition auf die RS-Virusvermehrung in Zellen untersucht. In einer neu entwickelten Ozonexpositionskammer wurden AM von BALB/c-Maeusen im Vergleich zu Reinluft gegenueber 100 ppb (parts per billon) bzw 500 ppb (0,2 bzw 1 mg/m3) Ozon exponiert. In einem ersten Teilbereich wurde der Einfluss der Ozonexposition auf die Funktionalitaet der Makrophagen untersucht, und zwar auf eine moegliche veraenderte Cytokinsekretion und die Mikrobizidie, dh auf die Faehigkeit der Zellen, Mikroorganismen erfolgreich zu vernichten. Die alleinige Ozonexposition reduzierte konzentrationsabhaengig die Produktion des Cytokins IL-6 und die mikrobiziden Eigenschaften der AM. Als weiteres wurde untersucht, ob Ozon einen Einfluss auf die Vermehrungsprozesse des RS-Virus in den Makrophagen hatte. Es konnte festgehalten werden, dass mit zunehmender Ozonkonzentration die Faehigkeit der RS-Viren zunahm, sich in den AM zu vervielfaeltigen. Es wurde geschlossen, dass bei hoeheren Ozonkonzentrationen eine verminderte Produktion an Interferon auftritt, so dass fehlende virostatische Immunmechanismen zu einem Anstieg der Vermehrungsrate an Viren fuehre. Bezueglich der Kombinationswirkung von Ozon und viraler Infektion kam es zu einem Anstieg der Cytokinsekretion im Vergleich zur alleinigen Ozonexposition. Diese Daten verdeutlichen den eine Immunreaktion verstaerkenden Effekt der RSV-Infektion. Unabhaengig davon war jedoch eine konzentrationsabhaengige Suppression durch Ozon zu beobachten. Diese in vitro Untersuchungen zeigen also auf, dass Ozon die Makrophagenfunktionen supprimiert, wobei zudem die Vermehrungsfaehigkeit der RS-Viren in den Ozon-behandelten Makrophagen steigt. Diese Forschungsergebnisse zeigen die Bedeutung von Kombinationseinfluessen von Luftverunreinigungen, die durch photochemische Prozesse entstehen, und einer Virusinfektion des Respirationstraktes. Damit haben sich fruehere Hinweise auf eine Kombinationswirkung von Ozon mit anderen Komponenten, zB Allergenen, bestaetigt. Diese Arbeitsgruppe erzielte bezueglich der Wechselwirkung einer viralen Infektion mit zellulaeren Parametern analoge Ergebnisse zu der Gruppe des Projektes PUG L92001, die ebenso feststellte, dass virale Infekte...
Das Projekt "Wirkung von Luftschadstoffen auf die Induktion und Freisetzung von Entzündungsmediatoren in respiratorischen Epithelien" wird vom Umweltbundesamt gefördert und von Universität Mainz, HNO-Klinik durchgeführt. Epidemiologische Untersuchungen belegen einen Zusammenhang zwischen Luftschadstoffbelastung und entzündlichen Erkrankungen der Atemwege. Einen besonderen Stellenwert hat in diesem Zusammenhang die Lösungsmittel- und Aldehyd-induzierte Rhinitis. Eigene Vorarbeiten haben gezeigt, dass auch niedrige Schadstoffdosen subklinische Schleimhautentzündungen verursachen können. Im Rahmen des Projektes werden mit Hilfe eines von unserer Arbeitsgruppe entwickelten in vitro Models Expositionen gegenüber arbeitsmedizinisch relevanten Schadgasen durchgeführt und die Synthese und Freisetzung von entzündungsrelevanten Zytokinen mittels ELISA-assays und quantitativer mRNA-Analytik untersucht. Wir konnten die Hochregulation verschiedener Zytokine nach Exposition mit hohen Gaskonzentrationen beobachten, was einen möglichen Wirkmechanismus nahe legt.
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